膽囊切除術(shù)后的腹瀉 (PCD) 是膽囊切除術(shù)后非常常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率高達(dá) 57.2%。現(xiàn)如今由于膽囊結(jié)石患病率的增加，以及膽囊切除術(shù)作為膽結(jié)石患者治療方案，使得PCD在全球范圍內(nèi)影響著大量人群的健康問題。目前對于PCD發(fā)病機(jī)制的深刻理解和有效的治療方案仍不清晰。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PCD患者腸道菌群存在差異，并且膽囊切除術(shù)對腸道菌群的影響也有相關(guān)報道。然而，PCD患者腸道菌群的改變僅是腹瀉本身的結(jié)果還是PCD發(fā)生的促成因素仍沒有定論。此外，腸道菌群變化如何以及在多大程度上導(dǎo)致PCD仍待解開。
2023年2月，來自復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院張紫平教授團(tuán)隊和王立順研究員團(tuán)隊在Gut Microbes（IF 9.434）上共同發(fā)表題為“Gut microbiota alteration after cholecystectomy contributes to post-cholecystectomy diarrhea via bile acids stimulating colonic serotonin”的文章。該研究通過糞菌移植膽囊切除術(shù)后腹瀉 （PCD）患者腸道菌群，確定菌群對腹瀉的影響。隨后通過菌群結(jié)構(gòu)功能分析揭示了色氨酸代謝途徑中血清素的重要作用，結(jié)合代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)菌群產(chǎn)生的次級膽汁酸可在體內(nèi)外刺激血清素產(chǎn)生，并通過TGR5 / TRPA1信號通路介導(dǎo)，最終建立腸道菌群-糞便BAs代謝物-TGR5/TRPA1-血清素軸并明確其在PCD過程中的關(guān)鍵作用機(jī)制。中科新生命提供了靶向色氨酸代謝組學(xué)檢測服務(wù)。
研究材料
糞便、血清、結(jié)腸組織、細(xì)胞系
臨床樣本：膽囊切除術(shù)后腹瀉（PCD）患者（n=10），非PCD患者（n=5），健康對照組（HC，n=5）；動物模型：抗生素處理的無菌鼠；細(xì)胞模型：大鼠胰島腫瘤細(xì)胞系RIN14B
技術(shù)路線
步驟1：16S rRNA測序揭示腸道菌群及其影響的代謝過程在膽囊切除術(shù)后腹瀉（PCD）發(fā)生中的關(guān)鍵作用；步驟2：靶向代謝組揭示PCD小鼠結(jié)腸中血清素的生物合成是其產(chǎn)生不良表型的關(guān)鍵因素；
步驟3：PCD腸道菌群通過影響血清素的生物合成及其受體5-HTRs驅(qū)動腸道過度蠕動；
步驟4：靶向代謝組再次揭示腸道菌群來源的次級膽汁酸可以刺激血清素的產(chǎn)生；
步驟5：阻斷BAs偶聯(lián)的TGR5/TRPA1受體信號通路可以顯著減輕PCD。
研究結(jié)果
1. 16S測序揭示腸道菌群及其影響的代謝過程在膽囊切除術(shù)后腹瀉（PCD）發(fā)生中的關(guān)鍵作用研究團(tuán)隊選擇了20例臨床糞便樣本進(jìn)行16S rRNA測序，其中包括膽囊切除術(shù)后腹瀉（PCD）患者（n=10），非PCD患者（n=5），以及健康對照組（HC，n=5）。α-多樣性分析顯示，與 HC 和 NonPCD 患者相比，PCD患者的菌群豐度及菌群多樣性顯著降低，PCoA以及NMDS也展示了不同樣本組別之間微生物分布與結(jié)構(gòu)的差異。接下來通過糞菌移植實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了基于微生物組的人源化小鼠模型，證實(shí)了PCD患者腸道菌群的改變導(dǎo)致了腹瀉的發(fā)生，并明確了結(jié)腸作為其發(fā)生相關(guān)生理過程的主要場所。
圖1 無菌小鼠在移植PCD腸道菌群后表現(xiàn)出腹瀉表型
為了進(jìn)一步探索微生物組的功能，作者對人源化模型鼠結(jié)腸腔內(nèi)容物中的菌群進(jìn)行了著重分析。結(jié)果顯示，與NonPCD 和 HC 小鼠相比，PCD小鼠擁有最少的OUT，并且微生物多樣性同樣顯著降低，菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大的變化。此外作者也通過PICRUSt 和 Tax4Fun兩款微生物宏基因功能預(yù)測工具，分析出色氨酸代謝途徑的變化可能是PCD小鼠發(fā)生腹瀉的潛在影響因素。
圖2 色氨酸代謝在PCD小鼠結(jié)腸內(nèi)容物的宏基因組功能預(yù)測中顯著富集
2. 靶向代謝組揭示PCD小鼠結(jié)腸中血清素的生物合成是其產(chǎn)生不良表型的關(guān)鍵因素
由于血清素（5-羥色胺）是色氨酸的基本代謝物，通常參與刺激腸道蠕動的調(diào)節(jié)。所以作者首先通過靶向代謝組學(xué)技術(shù)量化了其在三組小鼠結(jié)腸和血清中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與 HC 和 NonPCD 相比，PCD小鼠結(jié)腸和血清中的血清素水平大約升高一倍，并且與腸胃道傳輸時間呈負(fù)相關(guān)。為了明確血清素的來源，作者也通過免疫組化等實(shí)驗(yàn)確認(rèn)血清素水平的升高并非來源于腸道嗜鉻細(xì)胞（血清素的主要合成細(xì)胞）的過度增殖，而是可能源于其在PCD小鼠結(jié)腸中的過量產(chǎn)生。后續(xù)的分子實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了上皮細(xì)胞中血清素受體 5-HT3R 和 5-HT4R過度表達(dá)介導(dǎo)的結(jié)腸血清素升高，可能是加速PCD小鼠結(jié)腸蠕動的關(guān)鍵驅(qū)動因素。
圖3 PCD腸道菌群導(dǎo)致小鼠結(jié)腸中血清素水平升高和其受體5-HTRs的過度表達(dá)
3. PCD 腸道菌群通過影響血清素的生物合成及其受體5-HTRs驅(qū)動腸道過度蠕動
為了進(jìn)一步證實(shí)血清素及其受體5-HTRs是PCD小鼠腸道加速蠕動的關(guān)鍵因素，作者進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，使用色氨酸羥化酶1抑制劑降低結(jié)腸中血清素的水平，以及通過血清素受體選擇性拮抗劑阻斷其與血清素的結(jié)合，可以顯著改善PCD小鼠腹瀉表型。這些結(jié)果證實(shí)了累積的血清素對結(jié)腸過度蠕動的影響，并證明了血清素受體5-HTRs的特異性阻斷對 PCD 小鼠的治療作用。
圖4 抑制血清素的合成和選擇性阻斷血清素受體5-HTRs可顯著改善PCD小鼠的腹瀉表型
為了確定腸道菌群對血清素合成的具體影響，作者在細(xì)胞層面進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。分別將清洗過的腸道菌群與過濾掉菌群后的糞便溶液糞與RIN14B 細(xì)胞系共同孵育，結(jié)果顯示腸道菌群的代謝物是影響血清素合成的關(guān)鍵因素。
圖5 PCD患者及其人源小鼠的微生物代謝物刺激了RIN14B細(xì)胞系中的血清素生物合成
4. 靶向代謝組再次揭示腸道菌群來源的次級膽汁酸可以刺激血清素的產(chǎn)生
之前的研究中作者已經(jīng)證實(shí)了腸道菌群紊亂導(dǎo)致的次級膽汁酸（BAs）代謝改變是PCD的關(guān)鍵原因，但是BAs 代謝產(chǎn)物的變化是否通過血清素導(dǎo)致PCD仍然未知。接下來作者通過靶向代謝組分析發(fā)現(xiàn)PCD小鼠糞便中的BAs代謝產(chǎn)物表達(dá)差異顯著，并在RIN14B細(xì)胞系以及模型鼠中進(jìn)一步確認(rèn)這些顯著變化的次級BAs對血清素合成的影響，最終體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外試驗(yàn)均證實(shí)了微生物來源的次級BAs可以刺激血清素的產(chǎn)生。
為了進(jìn)一步證實(shí)次級BAs誘導(dǎo) PCD 患者血清素的過量產(chǎn)生，作者分析了糞便膽汁酸代謝和色氨酸代謝。結(jié)果顯示與 HC 和非 PCD 相比，PCD 患者糞便中BAs代謝物的表達(dá)具有顯著差異，并且KEGG通路富集分析也顯示色胺代謝途徑在 PCD 患者的糞便中明顯富集。進(jìn)一步結(jié)合16sRNA測序分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)次級BAs的積累可能是由于PCD腸道菌群中過多的BAs代謝菌引起的，如梭狀芽孢桿菌以及為鑒定的Lachnospiraceae。
圖6 微生物來源的次級膽汁酸誘導(dǎo)血清素的過量產(chǎn)生
5. 阻斷BAs偶聯(lián)的TGR5/TRPA1受體信號通路可以顯著減輕PCD
部分次級膽汁酸，如DCA、LCA和HDCA被發(fā)現(xiàn)是G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1 (GPBAR1) 或 TGR5的特異性激動劑，瞬時受體電位錨蛋白1 (TRPA1) 可使腸嗜鉻細(xì)胞在TGR5激活后分泌血清素以調(diào)節(jié)腸胃運(yùn)動。因此，作者為了驗(yàn)證菌群BAs代謝產(chǎn)物在PCD中的腹瀉誘導(dǎo)作用，通過SBI-115和HC-030031兩種選擇性阻斷劑阻斷了這兩種受體，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)合腹瀉相關(guān)表型實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了微生物來源的次級BAs在PCD中過度促進(jìn)腸道蠕動的作用，并提示了TGR5 拮抗劑和 TRPA1 抑制劑對 PCD 的潛在治療功效。
圖7 PCD腸道菌群通過TGR5/TRPA1信號通路誘發(fā)腹瀉
文章小結(jié)
該研究證實(shí)了腸道菌群的改變影響PCD發(fā)生的因果關(guān)系，并揭示了該過程中的腸道菌群-糞便BAs代謝物-TGR5/TRPA1-血清素軸。因此減少腸道血清素的產(chǎn)生或阻斷血清素受體可能是治療PCD的新方式。此外阻斷BAs偶聯(lián)的TGR5/TRPA1受體信號通路可以顯著減輕PCD，提示了TGR5拮抗劑和 TRPA1抑制劑對 PCD的潛在治療功效。