細胞增殖與毒性

1、MTT（噻唑藍）
MTT是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷，具有細胞膜滲透性。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠催M入的MTT還原成為水不溶性的深藍色MTT-甲臜結(jié)晶，而死細胞不具有此功能。甲臜結(jié)晶是不能穿透細胞膜，因此沉積在處于增殖且未受損傷的細胞內(nèi)。甲臜結(jié)晶可用DMSO或者酸化的異丙醇溶解出來，酶標儀下測定570 nm的吸光度反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量與活細胞數(shù)目成正比，用以評估細胞存活狀況。

2、CCK-8（Cell Counting Kit–8）
CCK-8中的WST-8被細胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的橙色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細胞數(shù)量成正比。基于CCK-8（WST-8）的試劑盒能高度準確地檢測細胞增殖，比MTT法及XTT法的靈敏度高5倍，能檢測更低的細胞數(shù)目。CCK-8可直接加入細胞樣品中，因此適合懸浮細胞和貼壁細胞的檢測。對細胞幾乎沒有毒性， 檢測完成后的細胞還可以繼續(xù)培養(yǎng)使用。

1、BrdU
Brdu，也稱為溴化去氧尿苷，一種合成的胸苷類似物，在S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結(jié)合到細胞DNA中。從而檢測細胞DNA合成和標記細胞分裂，凋亡等行為。

2、EdU
EdU法檢測是Brdu方法的升級和突破。EdU（5-溴-2-脫氧尿嘧啶）是一種嘧啶類似物，可在DNA合成期整合入DNA雙鏈。EdU法檢測是基于“點擊”反應(yīng)，一種由銅催化的疊氮化合物和炔烴的原子共價反應(yīng)。

ATP是細胞內(nèi)最重要的能量分子，可以用來衡量細胞新陳代謝水平，并與活細胞數(shù)目具有良好的線性關(guān)系，因此，可通過ATP含量反應(yīng)活細胞的數(shù)目。借ATP依賴的熒光素酶催化的熒光素發(fā)光反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光信號測定細胞內(nèi) ATP含量，從而檢測細胞活力或定量檢測活細胞數(shù)目，靈敏度高、線性范圍寬。

Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490 nm，Em=515 nm）。 因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細胞內(nèi)并發(fā)出強綠色熒光。

細胞凋亡與吞噬

在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。

Hoechst 33342 是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，它在嵌入雙鏈 DNA 后釋放強烈的藍色熒光，對細胞的毒性較低。Hoechst 33342 常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。也可以用于普通的細胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。

組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA會發(fā)生斷裂，在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入FITC-12-dUTP，從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

JC-1/JC-10是一種陽離子脂質(zhì)熒光染料，可作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1/JC-10有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，低濃度時，以單體存在，可檢測到綠色熒光，用流式檢測時，通常為FL-1通道(和FITC同通道）高濃度時，以多聚體存在，可檢測到紅光，流式檢測通常為FL-2通道（和PE同通道)。因JC-1/JC-10濃度的變化,在單體和多聚體之間形成一個可逆的轉(zhuǎn)變過程。

正常細胞，膜電位正常時，JC-1/JC-10通過線粒體膜極性進入線粒體內(nèi)，并因濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體，而凋亡細胞，線粒體跨膜電位去極化，JC-1/JC-10從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。故而可以通過檢測綠色和紅色熒光檢測線粒體膜電位的變化。

細胞衰老

細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍色產(chǎn)物，從而在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到藍色著色的表達β-半乳糖苷酶的細胞。

細胞周期（cell cycle)：指細胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S  期、G2期和M期組成。衰老的細胞阻滯于G1期，失去了對有絲分裂原的反應(yīng)能力和合成DNA的能力，不能進入S 期。

PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與 DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個時期的百分含量。

亞細胞研究

細胞骨架是一個動態(tài)且自適應(yīng)的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，由微管、肌動蛋白絲和中間絲三種主要聚合物組成，在細胞內(nèi)執(zhí)行多種重要功能，包括空間組織、與外部環(huán)境連接以及產(chǎn)生力使細胞移動和變形，其功能通過眾多細胞質(zhì)蛋白和細胞器的整合活動實現(xiàn)。

線粒體是細胞的能量工廠，是細胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，為細胞的活動提供了能量，細胞生命活動所需的能量95％來自線粒體。除了為細胞供能外，線粒體還參與諸如細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，并擁有調(diào)控細胞生長和細胞周期的能力。

細胞核的結(jié)構(gòu)有核膜、核仁、染色質(zhì)、核基質(zhì)。主要功能是遺傳物質(zhì)DNA儲存和復(fù)制的主要場所，是細胞遺傳和代謝的控制中心。

1.核膜：雙層膜，其上有核孔，是細胞核與細胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換通道，表現(xiàn)出明顯的選擇性，RNA、蛋白質(zhì)等大分子進出必須通過核孔。
2.核仁：在細胞有絲分裂過程中周期性消失（前期）和重現(xiàn)（末期）。
3.染色質(zhì)：能被堿性染料染成深色的物質(zhì)，主要由DNA和蛋白質(zhì)組成。
4.核基質(zhì)：是核中除染色質(zhì)與核仁以外的成分，包括核液與核骨架兩部分。

溶酶體是分解蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的細胞器。溶酶體具單層膜，形狀多種多樣，是0.025～0.8微米的泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含許多水解酶。溶酶體在細胞中的功能是分解從外界進入到細胞內(nèi)的物質(zhì)，也可消化細胞自身的局部細胞質(zhì)或細胞器。溶酶體的基本功能是對生物大分子的強烈消化作用,這對于維持細胞的正常代謝活動及防御微生物的侵染等都有重要的生物學(xué)意義。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)的一個精細的膜系統(tǒng)。是交織分布于細胞質(zhì)中的膜的管道系統(tǒng)。兩膜間是扁平的腔、囊或池。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有兩種類型，一類是在膜的外側(cè)附有許多核糖體，這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)叫粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或叫粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；另一類在膜的外側(cè)不附有核糖體，表面光滑，稱光滑型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或叫滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外與細胞膜相連，內(nèi)與核膜的外膜相通，將細胞中的各種結(jié)構(gòu)連成一個整體，具有承擔(dān)細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)淖饔谩?nèi)質(zhì)網(wǎng)能有效地增加細胞內(nèi)的膜面積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能將細胞內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)有機地聯(lián)結(jié)成一個整體。

細胞膜，又稱細胞質(zhì)膜（plasma membrane），厚度約為7～8nm，細胞膜的化學(xué)組成基本相同，主要由脂類、蛋白質(zhì)和糖類組成。其中，脂質(zhì)的主要成分為磷脂和膽固醇。此外，細胞膜中還含有少量水分、無機鹽與金屬離子等。細胞膜作為細胞的邊界可將細胞內(nèi)部與外環(huán)境分隔開，不僅在結(jié)構(gòu)上為細胞提供了相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，并參與了包括物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡和細胞自噬在內(nèi)的許多重要生理活動。