鑒于單獨(dú)的基因組信息的有限性，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所陳文連團(tuán)隊聯(lián)合江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院王偉團(tuán)隊以及香港浸會大學(xué)賈偉團(tuán)隊等多個科研單位合作從多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組+蛋白質(zhì)組+磷酸化蛋白質(zhì)組+代謝組）層面上揭示了食管鱗狀細(xì)胞癌的分子特征及潛在治療靶點(diǎn)。研究成果以“A multi-omics study delineates new molecular features and therapeutic targets for esophageal squamous cell carcinoma”為題，發(fā)表在Clinical and Translational Medicine（IF：8.554）上。
多組學(xué)樣本分組設(shè)置及臨床特征
1.?人轉(zhuǎn)錄組RNA測序+DIA蛋白質(zhì)組+磷酸化蛋白質(zhì)組+代謝組：
食管鱗狀細(xì)胞癌癌組織（ESCC）：n=24
食管鱗狀細(xì)胞癌正常癌旁組織（NAT）：n=24
注：由于組織樣本量有限，僅有三對樣本進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。
2.?人食管鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床特征：
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DIA蛋白質(zhì)組共檢測了6507個蛋白，保留在超過50%樣本中有定量值的共計5511個蛋白進(jìn)入下游分析。磷酸化蛋白質(zhì)組共檢測到來自3215個蛋白上的共11232個磷酸化位點(diǎn)，保留無定量缺失值的來自2740個蛋白的7186個磷酸化位點(diǎn)進(jìn)入下游分析。代謝組保留在超過50%樣本中有定量值的共計200個代謝物進(jìn)入下游分析。
1.?食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）的多組學(xué)分子景觀
（1）與已有的轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)比較
在已經(jīng)報道的53對ESCC癌和癌旁組織的轉(zhuǎn)錄組RNA測序結(jié)果中，癌 vs 癌旁共有116個上調(diào)基因和43個下調(diào)基因。其中，116個上調(diào)基因中的76個（65.52%）、43個下調(diào)基因中的32個（74.41%）在本研究的RNA測序結(jié)果中出現(xiàn)了一致的變化趨勢。這表明本結(jié)果與已報道結(jié)果的一致性。
（2）ESCC癌組織和癌旁組織在多組學(xué)層面上有明顯的差異
研究者隨后分別從轉(zhuǎn)錄組（基因mRNA表達(dá)和mRNA異構(gòu)體（isoform）層面）、蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和代謝組層面對所有樣本分別進(jìn)行非監(jiān)督的表達(dá)量聚類分析及整合多組學(xué)聚類。結(jié)果表明，在各種組學(xué)層面及整合多組學(xué)層面上，ESCC癌組織和癌旁組織都有明顯的差異。最后，研究者是用DIABLO算法計算了個各組學(xué)間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，任意兩個組學(xué)間都有高的相關(guān)性，這表明ESCC組織和癌旁組織之間的差異性在各個組學(xué)層面上是一致的。
正常小鼠和食管癌小鼠的食管組織轉(zhuǎn)錄組RNA測序和代謝組學(xué)結(jié)果分析也顯示出顯著的差異。這表明，ESCC癌組織和正常組織間的差異性在物種間的保守性。
2.?轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的不一致性表明了廣泛的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控
基因的表達(dá)經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄成mRNA和mRNA翻譯為蛋白的兩個主要過程。研究者比較了在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組層面上的相關(guān)性（共6174個mRNA-蛋白質(zhì)對）。結(jié)果表明，癌組織和癌旁組織的mRNA和蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性很低。在癌和癌旁組織中，基因?qū)用嫔系膍RNA的蛋白質(zhì)相關(guān)性中位值分別為0.06和0，而樣本層面上的mRNA和蛋白質(zhì)相關(guān)性中位值分別為0.20和0.15。該結(jié)果意味著在組織中存在著廣泛的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控。
研究者繼續(xù)比較了癌 vs 癌旁組織mRNA變化倍數(shù)從下調(diào)到上調(diào)的順序增長過程中，相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化情況。總體來看，在癌組織中有更多的表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)，且不管是mRNA變化下調(diào)、不變和上調(diào)，都有相應(yīng)的蛋白質(zhì)發(fā)生上調(diào)變化。同樣地，癌組織中也有更多的上調(diào)mRNA。這些結(jié)果表明，癌組織的mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)，且有更活躍的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
研究者假設(shè)在mRNA和蛋白水平均上調(diào)的基因（定義為高轉(zhuǎn)錄和高翻譯活性的基因）是導(dǎo)致可以觀測到的癌和癌旁組織間的差異的核心上游信號。于是對這部分共480個基因進(jìn)行了GO功能富集分析，顯示了RNA加工、RNA剪接和基因表達(dá)的活性在ESCC組織中的顯著增強(qiáng)。這些基因中包括了在癌組織中蛋白表達(dá)量非常高的富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子10（SRSF10）、剪接因子3A亞基2（SF3A2）、切割活化因子2（CSTF2）和復(fù)制時間調(diào)節(jié)因子1（RIF1）。在ESCC癌組織蛋白質(zhì)組結(jié)果中SRSF10、SF3A2,和CSTF2表達(dá)量與增殖標(biāo)志物 Ki-67和/或PCNA正相關(guān)。此外，SRSF10 和SF3A2與分化標(biāo)志物S100A14負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，SRSF10、SF3A2和CSTF2 可能較活躍地參與了ESCC的惡性進(jìn)展。
3.?整合分析ESCC的分子通路和代謝特征
因為mRNA和蛋白的高度不一致，研究者使用蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和代謝組進(jìn)一步分析人ESCC中的分子改變。
（1）蛋白質(zhì)組：癌 vs 癌旁共得到2890個差異蛋白。差異蛋白的KEGG通路富集分析顯示ESCC腫瘤中有更高水平的剪接體、組蛋白和核糖體相關(guān)蛋白，以及低水平的細(xì)胞骨架蛋白。研究者繼續(xù)使用GSVA對差異蛋白的活性進(jìn)行量化，在ESCC中共發(fā)現(xiàn)了157個顯著變化的通路，包括與RNA轉(zhuǎn)錄/加工/代謝、DNA合成和修復(fù)、蛋白合成、蛋白水解和細(xì)胞周期相關(guān)的通路。而與細(xì)胞連接、細(xì)胞間相互作用相關(guān)的通路則減弱。
（2）磷酸化蛋白質(zhì)組：癌 vs癌旁共得到517個差異磷酸化位點(diǎn)。研究者對這些差異磷酸化位點(diǎn)的歸屬蛋白進(jìn)行GSVA分析，結(jié)果顯示在ESCC腫瘤中存在著參與RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝的通路的激活。
（3）代謝組：癌 vs癌旁共從200個代謝物中篩選得到113個差異代謝物（占比56.50%）。其中94個差異代謝物上調(diào)（占比83.19%）。差異代謝物的MESA分析顯示，有17個代謝通路在ESCC腫瘤中有顯著擾動。其中10個通路參與氨基酸代謝，這表明在人類ESCC中的氨基酸代謝受到主要干擾。而一個ESCC細(xì)胞系KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)上清的分析顯示，ESCC細(xì)胞消耗了更多的氨基酸包括胱氨酸、精氨酸、脯氨酸及其他氨基酸。
（4）整合分析：研究者利用蛋白質(zhì)組和代謝組的結(jié)果對最受干擾的精氨酸和脯氨酸代謝通路進(jìn)行整合網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明ESCC腫瘤選擇性表達(dá)多個代謝酶，以加速氨基酸的生產(chǎn)。另外，考慮到代謝物在細(xì)胞表型決定中的重要作用，研究者分析了能表征ESCC重要細(xì)胞表型的差異蛋白物和差異蛋白質(zhì)間的相關(guān)性。13個代謝物與乙-醛脫氫酶1（ALDH1，一個ESCC干性標(biāo)志物）正相關(guān)。該結(jié)果表明，變化的代謝物可能參與影響ESCC的干性。
4.?鑒定有預(yù)后潛力的蛋白標(biāo)志物（上調(diào)差異蛋白質(zhì)）
接下來， 研究者通過分析ESCC癌 vs 癌旁的差異蛋白尋找與患者生存相關(guān)及參與ESCC進(jìn)展的蛋白。單因素Cox模型分析共得到118個有預(yù)后潛力的蛋白。這其中，66個蛋白與疾病復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險正相關(guān)，而剩余蛋白與疾病復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險負(fù)相關(guān)。KEGG富集分析顯示，這118個蛋白主要富集在吞噬體、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、P53信號通路、果糖和甘露糖代謝等通路。
66個與疾病復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險正相關(guān)的蛋白中有23個蛋白的蛋白和mRNA表達(dá)變化趨勢一致，表明這些蛋白是受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。而其他蛋白的蛋白變化趨勢和mRNA變化趨勢不一致，表明是受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。值得注意的是，14個基因，包括HACD2、RBM3、MRPL14、PCNP、XPNPEP3、TBC1D5、BPTF、CEP170B、PTPN13、NAA50、SNRPF、NUP43、FBL和CHCHD2在蛋白質(zhì)和mRNA水平上都明顯上調(diào)。研究者在4-NQO（4-**喹-啉 N-氧化物）誘導(dǎo)的ESCC小鼠中檢測了這些基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。其中3個基因，RBM3、BPTF和FBL，在ESCC小鼠的食道組織中相對于對照組小鼠明顯增加，表明這三個基因在ESCC中的上調(diào)在不同物種中是保守的。接下來，研究者選擇了5個在ESCC腫瘤中上調(diào)最多的蛋白，包括HACD2、RBM3、MRPL14、PCNP和XPNPEP3，以及BPTF和FBL進(jìn)行進(jìn)一步研究。
?5. FBL可作為不利預(yù)后的生物標(biāo)志物
研究者在第二個隊列（n=41）組織樣本中檢測了前述7個蛋白的表達(dá)量，并評估這些蛋白的預(yù)后潛力。結(jié)果表明，F(xiàn)BL、XPNPEP3和BPTF在癌組織中顯著上調(diào)。研究者繼續(xù)在ESCC細(xì)胞系敲減FBL、XPNPEP3和BPTF，檢測這三個基因?qū)SCC惡性的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)BL缺失顯著下調(diào)細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達(dá)，并且顯著抑制ESCC細(xì)胞的生長。此外，F(xiàn)BL缺失顯著抑制了PI3K/AKT信號通路，該通路是促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的重要信號通路。體內(nèi)動物水平上的結(jié)果顯示，F(xiàn)BL缺失顯著抑制移植瘤小鼠腫瘤的生長。而XPNPEP3和BPTF并未影響ESCC細(xì)胞的生長。綜合以上結(jié)果表明，是FBL而非XPNPEP3和BPTF，通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，在ESCC細(xì)胞生長中發(fā)揮重要作用。
緊接著，研究者在第三個ESCC隊列（n=100）中使用IHC檢測了FBL的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了FBL在ESCC腫瘤中的高表達(dá)。重要的是，高的FBL蛋白表達(dá)預(yù)示著ESCC患者的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率較低。而TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)的分析顯示，F(xiàn)BL的高mRNA水平與ESCC患者糟糕的總生存率無關(guān)，這表明FBL mRNA與ESCC患者的預(yù)后沒有關(guān)系。總體，這些發(fā)現(xiàn)表明，腫瘤組織中高表達(dá)FBL蛋白預(yù)示著ESCC患者預(yù)后不佳。
6.?發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原和靶向潛在的腫瘤驅(qū)動因子和重要激酶的藥物
新腫瘤抗原(包括CT抗原)的鑒定將為開發(fā)用于癌癥免疫治療的疫苗提供更多的機(jī)會。通過分析蛋白質(zhì)組結(jié)果，研究者發(fā)現(xiàn)了4個已知的CT抗原MAGEB3、MAGEA4、MAGEA8和SPAG9在ESCC組織中顯著上調(diào)，變化倍數(shù)（FC）從1.84到223.50。緊接著，研究者將蛋白質(zhì)組結(jié)果與已知的潛在癌癥驅(qū)動因子列表和激酶列表進(jìn)行比較，分別發(fā)現(xiàn)了32個潛在腫瘤驅(qū)動因子和29個激酶在ESCC癌組織中有4倍以上的表達(dá)上調(diào)。通過在兩個藥物數(shù)據(jù)庫Drugbank和PKIDB進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，21.88%(7/32)的癌癥驅(qū)動因子和86.21%(25/29)的激酶有靶向抑制劑。這些抑制劑可以作為ESCC的新療法進(jìn)行測試。
研究總結(jié)
研究者對24對人食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）癌組織和配對的正常鄰近組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和代謝組特征分析，以確定ESCC的新的分子特征和潛在的治療靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，有一小群基因與ESCC活躍的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后調(diào)控有關(guān)。通過分析蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，揭開了與癌癥病因密切相關(guān)的ESCC相關(guān)信號和代謝途徑的網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析顯示，參與RNA轉(zhuǎn)錄、加工和代謝的某些途徑在ESCC中受到激活。此外，研究者發(fā)現(xiàn)了與ESCC預(yù)后密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中FBL對ESCC細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長至關(guān)重要，且FBL的高表達(dá)預(yù)示著不利的預(yù)后。最后，研究者分析發(fā)現(xiàn)了ESCC癌組織中的CT抗原、腫瘤驅(qū)動因子及激酶，并分析了已有的靶向這些分子的藥物，這將為ESCC新療法的開發(fā)提供啟發(fā)。
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