上期我們已經(jīng)對(duì)AAV在免疫細(xì)胞中的靶向策略從注射方式的角度進(jìn)行了討論。免疫細(xì)胞的種類繁多，因?yàn)?strong>免疫細(xì)胞本身的特性它的感染效率不高，針對(duì)免疫細(xì)胞的特異性的啟動(dòng)子種類也比較少。隨著細(xì)胞和基因治療的火熱進(jìn)行，有越來(lái)越多的針對(duì)靶向免疫細(xì)胞的AAV進(jìn)行了研究，接下來(lái)小編將分成幾期進(jìn)行相關(guān)的實(shí)例分析。這一期我們一起來(lái)看看針對(duì)巨噬細(xì)胞做的相關(guān)研究。
Engineering monocyte/macrophage?specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing[1]
高雪氏病（GD）是由GBA基因突變引起的遺傳學(xué)疾病，它導(dǎo)致葡萄糖腦苷酯酶（GCase）缺乏，從而導(dǎo)致高糖脂降解負(fù)擔(dān)造成很多細(xì)胞累積糖脂，尤其是巨噬細(xì)胞。主要有三種臨床類型：GD1、GD2和GD3。GD1是最常見的表型，通常表現(xiàn)為肝脾腫大、骨疾病以及細(xì)胞減少還有不同程度的肺部疾病。目前治療GD1的方法包括口服葡糖苷酸合成酶的小分子抑制劑（SRT）和葡萄糖腦苷脂酶替代物（ERT）靶向巨噬細(xì)胞通過甘露糖介導(dǎo)的攝取。除此之外，異體造血干細(xì)胞移植已經(jīng)成功用于GD的一次性治療。它的治療效果是通過提供移植的GCase組分的巨噬細(xì)胞。這表明僅恢復(fù)巨噬細(xì)胞的GC酶功能就可以糾正GD1的表型。因此，在病人自己的造血系統(tǒng)中恢復(fù)GC酶的活性建立一種自體的方法，就可以避免異體造血干細(xì)胞的許多風(fēng)險(xiǎn)。
由于這些原因，研究人員通過把非靶向的基因添加到人類造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中進(jìn)行探索：首先使用的是逆轉(zhuǎn)錄病毒后來(lái)使用慢病毒載體，在小鼠的GD模型中取得了很好的結(jié)果。由于插入性突變和惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生，需要開發(fā)針對(duì)性的基因添加策略，以產(chǎn)生人類治療的轉(zhuǎn)基因HSPCs。現(xiàn)代基因組編輯工具可以實(shí)現(xiàn)單堿基對(duì)精度的基因修飾和整合。細(xì)菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)衍生出的一個(gè)高度可工程化的平臺(tái)已被優(yōu)化用于基因編輯。Cas9會(huì)刺激兩種修復(fù)途徑的一種：(1) 非同源末端連接（NHEJ）以及(2)同源定向修復(fù)（HDR）。
在人類HSPCs中，AAV6基因組是一種有效的同源修復(fù)方法。HDR途徑不僅可以利用來(lái)實(shí)現(xiàn)單堿基對(duì)的變化，而且還可以將整個(gè)表達(dá)盒整合到非必要的安全港位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控區(qū)、轉(zhuǎn)基因和可選擇標(biāo)記的可調(diào)整組合的穩(wěn)定表達(dá)。一個(gè)潛在的安全港基因座是CCR5。這篇文獻(xiàn)中，研究人員利用RNP（sgRNA和Cas9核糖核蛋白復(fù)合物）/AAV6平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了GCase盒能有效的整合到CCR5安全位點(diǎn)。并且利用一個(gè)在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)的系譜特異性啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，研究人員實(shí)現(xiàn)了GCase在受影響的細(xì)胞系中的表達(dá)，同時(shí)也盡量減少在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中的異位表達(dá)。
如下圖所示，研究人員為了驗(yàn)證CD68S啟動(dòng)子的系別特異性，將CD68S-GCase-Citrine+和SFFV-GCase-Citrine+與HSPCs一起培養(yǎng)。SFFV-GCase-Citrine+細(xì)胞的比例在HSPC和巨噬細(xì)胞中都保持穩(wěn)定。相反，CD68S-GCase-Citrine+細(xì)胞的百分比在HSPC培養(yǎng)物中減少，但在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中保持不變。由CD68SGCase-Citrine+和SFFV-GCase-Citrine+HSPCs衍生的巨噬細(xì)胞表達(dá)的GCase比巨噬細(xì)胞高2-3倍。
病毒產(chǎn)品 | AAV6-CD68S |
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 | NSG小鼠 |
注射方式 | 體外感染細(xì)胞,回輸小鼠 |
注射量 | MOI=1*104~2*104 |
STING Induces Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Promoting Calcium-Dependent Caspase 1-GSDMD Processing in Macrophages[2]
主要內(nèi)容：
巨噬細(xì)胞中干擾素基因刺激因子（STING）對(duì)肝臟缺血再灌注損傷（IRI）有重要的調(diào)節(jié)作用，但是STING依賴性的先天免疫的基本機(jī)制激活肝臟巨噬細(xì)胞（Kupffer）的機(jī)制仍然不清楚。這篇文獻(xiàn)研究了STING對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞的熱化作用以及肝臟IRI的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。使用了磷酸脂質(zhì)體來(lái)阻斷肝臟的巨噬細(xì)胞，然后使用AAV-STING-RNAi-F4/80-EGFP轉(zhuǎn)染到小鼠的門靜脈中，在14天之后建立了肝臟的IRI模型。體外實(shí)驗(yàn)使用了STING特異性的siRNA處理肝臟的巨噬細(xì)胞，建立了缺氧-復(fù)氧（H/R）模型。結(jié)果表明，STING的表達(dá)隨著肝臟IRI的增加而增加，但是在磷酸脂質(zhì)體阻斷肝臟巨噬細(xì)胞之后，STING的表達(dá)量明顯下降。敲除STING后，巨噬細(xì)胞中的Caspase 1-GSDMD的激活和肝臟IRI得到了緩解。更有趣的是，缺氧/復(fù)氧（H/R）增加了肝臟巨噬細(xì)胞中的鈣離子濃度，但STING敲除后，鈣離子濃度卻下降。BAPTA-AM抑制肝臟巨噬細(xì)胞的鈣離子后，巨噬細(xì)胞的熱化現(xiàn)象明顯減少，但STING的表達(dá)卻沒有明顯減少。這些結(jié)果表明敲除STING可以減少鈣依賴性的巨噬細(xì)胞caspase 1-GSDMD介導(dǎo)的肝臟IRI，是一種潛在的治療方法。
在本文中，研究人員證實(shí)敲除巨噬細(xì)胞中的STING可減輕肝臟IRI。在肝臟IRI建模前14天，用AAV-STING-RNAi-F4/80-EGFP預(yù)處理（靜脈注射）小鼠，對(duì)照組病毒為AAV-Ctrl-F4/80-EGFP。從各組肝臟中分離出KCs，然后用WB以及免疫組化檢測(cè)各組KCs中STING的表達(dá)。
病毒產(chǎn)品 | AAV6-F4/80 |
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 | C57BL/6N野生型小鼠（8-10周） |
注射方式 | 門靜脈（肝巨噬細(xì)胞Kupffer） |
注射量 | 1 × 1011vg |
Mannose receptor modulates macrophage polarization and allergic inflammation through miR-511-3p[3]
主要內(nèi)容：
甘露糖受體（MRC1/CD206）被認(rèn)為是通過多種糖類過敏原介導(dǎo)過敏性吸食和哮*。研究人員證明了一種保護(hù)機(jī)制，在該機(jī)制中MRC1通過其內(nèi)含的miR-511-3p限制過敏性炎癥。作者利用野生型C57和MRC1介導(dǎo)的肺巨噬細(xì)胞對(duì)過敏原的攝取和肺部炎癥進(jìn)行了研究。在巨噬細(xì)胞的極化和過敏原的誘導(dǎo)中miR-511-3p的作用是在轉(zhuǎn)染了(AAV)–miR-511-3p的小鼠中誘導(dǎo)肺部的炎癥。
如下圖：研究人員通過一個(gè)表達(dá)miR-511-3p的AAV載體（AAV-CMV-EG）感染小鼠，通過流式去檢測(cè)BAL和肺部巨噬細(xì)胞的表達(dá)，通過免疫熒光進(jìn)行染色也進(jìn)行了驗(yàn)證。之后用這些被AAV感染的小鼠用于小鼠哮*模型的建立。結(jié)果表明被AAV-miR-511-3p感染的小鼠大大抑制了由造模引起的支氣管周圍炎癥和絨毛膜細(xì)胞增生。
病毒產(chǎn)品 | AAV9-CMV |
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 | C57BL/6N野生型小鼠（6-8周） |
注射方式 | 氣管內(nèi)注射（肺巨噬） |
注射量 | 5x1010 pfu~1 × 1011vg |
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1.Scharenberg, S.G., et al., Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 3327.
2.Wu, X.Y., et al., STING Induces Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Promoting Calcium-Dependent Caspase 1-GSDMD Processing in Macrophages. Oxid Med Cell Longev, 2022. 2022: p. 8123157.
3.Zhou, Y., et al., Mannose receptor modulates macrophage polarization and allergic inflammation through miR-511-3p. J Allergy Clin Immunol, 2018. 141(1): p. 350-364 e8.