體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化是一種潛在的再生療法，可以用于損傷和疾病治療。之前的研究認(rèn)為通過(guò)異位表達(dá)或敲低特定因子，可以將星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元。然而，通過(guò)嚴(yán)格的譜系追蹤實(shí)驗(yàn)證明，先前認(rèn)為是由星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)的神經(jīng)元，實(shí)際上是由內(nèi)源性神經(jīng)元轉(zhuǎn)化而來(lái)。通過(guò)AAV介導(dǎo)NEUROD1和報(bào)告基因的共表達(dá)，可以有效地誘導(dǎo)報(bào)告基因標(biāo)記的神經(jīng)元，但這些神經(jīng)元無(wú)法通過(guò)譜系追蹤追溯到星形膠質(zhì)細(xì)胞。相反，逆行標(biāo)記方法表明內(nèi)源性神經(jīng)元是這些表達(dá)AAV標(biāo)記神經(jīng)元的來(lái)源。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了譜系追蹤策略在體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化研究中的重要性。
德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心分子生物學(xué)系和哈蒙再生科學(xué)與醫(yī)學(xué)中心的研究者們，通過(guò)嚴(yán)格的譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，之前研究報(bào)道認(rèn)為的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元（astrocyte-to-neuron，AtN）并非起源于常駐星形膠質(zhì)細(xì)胞，而是來(lái)自AAV感染的內(nèi)源性神經(jīng)元。研究成果以“Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo”為題，發(fā)表在Cell（IF：66.85）上。
研究結(jié)果
1. 通過(guò)AAV靶向腦星形膠質(zhì)細(xì)胞
研究人員比較了幾種常用AAV血清型在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的特異性表達(dá)能力。研究結(jié)果顯示，注射后4天，大多數(shù)AAV病毒主要在GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到基因表達(dá)。然而，到了注射后14天，AAV8和AAV9在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降，而在神經(jīng)元中的表達(dá)增加。相比之下，AAV2和AAV5在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的特異性表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇了AAV5作為較為理想的AAV血清型。
2. 通過(guò)NEUROD1進(jìn)行高效的體內(nèi)AtN轉(zhuǎn)化？
研究人員通過(guò)注射不同病毒到小鼠皮層進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，注射ND1-mCh病毒后，17天時(shí)79.8%的細(xì)胞為神經(jīng)元，與對(duì)照組相比明顯增加。然而，整體神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞密度沒(méi)有顯著變化，此外，注射ND1-mCh病毒未觀察到細(xì)胞表達(dá)未成熟神經(jīng)元標(biāo)志物。這表明ND1-mCh能有效標(biāo)記神經(jīng)元，但不會(huì)引起神經(jīng)元密度的整體增加或未成熟神經(jīng)元的出現(xiàn)。
3. 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞不是NEUROD1誘導(dǎo)的標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元的起源。
體內(nèi)重編程將反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的治療前景很有希望。通過(guò)在受傷的小鼠皮層進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究人員成功地將活性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。然而，這種轉(zhuǎn)化的效率很低，并未觀察到顯著增加周圍神經(jīng)元密度的現(xiàn)象。因此，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)NEUROD1誘導(dǎo)的神經(jīng)元的形成沒(méi)有起到重要作用。
4. 譜系示蹤的星形膠質(zhì)細(xì)胞不是NEUROD1誘導(dǎo)的標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元的起源。
研究人員使用他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠模型追蹤星形膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)。通過(guò)注射不同病毒，他們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的細(xì)胞并非源自星形膠質(zhì)細(xì)胞，而是可能來(lái)自其他細(xì)胞類型。這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)重編程中的貢獻(xiàn)有限。
5. 腦損傷未能促使NEUROD1將被追蹤的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。
研究人員在經(jīng)過(guò)他莫昔芬處理的小鼠中進(jìn)行了腦損傷，并注射了mCherry或ND1-mCherry病毒。結(jié)果顯示，ND1-mCherry病毒能夠有效誘導(dǎo)mCherry+NeuN+細(xì)胞的產(chǎn)生，表明環(huán)境條件可能對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化起調(diào)控作用。然而，只有很少一部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)mCherry、NeuN和YFP，這可能是由于遺傳標(biāo)記背景的變異所致。
6. 基于AAV的Cre-FLEX系統(tǒng)未能限制星形膠質(zhì)細(xì)胞中的基因表達(dá)。
研究人員使用基于AAV的Cre-FLEX系統(tǒng)進(jìn)行Astrocyte-to-Neuron轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在細(xì)胞類型特異性方面存在限制。雖然可以成功觀察到轉(zhuǎn)化后的神經(jīng)元，但部分AAV血清型表達(dá)的Cre也在神經(jīng)元中活躍，導(dǎo)致缺乏準(zhǔn)確的細(xì)胞追蹤。因此，該系統(tǒng)需要改進(jìn)以實(shí)現(xiàn)更好的細(xì)胞類型特異性。
7. 限制于星形膠質(zhì)細(xì)胞的NEUROD1無(wú)法引起AtN轉(zhuǎn)換。
研究者使用了限制NEUROD1在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的策略，并注射了F-mCh或F-ND1-mCh AAV5病毒。結(jié)果表明，僅在成年星形膠質(zhì)細(xì)胞中限制NEUROD1表達(dá)時(shí)，無(wú)法迅速誘導(dǎo)神經(jīng)元形成。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，即使在腦損傷后，仍無(wú)法通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性的NEUROD1誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。
8. 他莫昔芬和遺傳背景都不會(huì)影響NEUROD1誘導(dǎo)報(bào)告基因陽(yáng)性神經(jīng)元的能力。
他莫昔芬處理對(duì)NEUROD1重編程能力的抑制不太可能發(fā)生，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，無(wú)論是在他莫昔芬處理前注射病毒還是延遲處理方案中，NEUROD1仍然能夠成功誘導(dǎo)mCherry+神經(jīng)元的形成，而且沒(méi)有受到Y(jié)FP追蹤的影響。因此，他莫昔芬處理不會(huì)阻斷NEUROD1的重編程能力。
9. NEUROD1誘導(dǎo)的標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元是內(nèi)源性神經(jīng)元。
遺傳譜系追蹤和BrdU標(biāo)記結(jié)果表明，駐留的星形膠質(zhì)細(xì)胞不是NEUROD1誘導(dǎo)的mCherry+神經(jīng)元的來(lái)源。相反，通過(guò)逆行標(biāo)記方法，研究人員發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性神經(jīng)元是NEUROD1誘導(dǎo)的mCherry+神經(jīng)元的來(lái)源。這些結(jié)果表明NEUROD1不能將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，而是依賴于內(nèi)源性神經(jīng)元作為轉(zhuǎn)化的來(lái)源。
10. 標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元可以由選擇性AAV表達(dá)因素誘導(dǎo)。
研究發(fā)現(xiàn)，使用hGFAP啟動(dòng)子下的AAV5病毒可以改變細(xì)胞類型特異性。通過(guò)檢查多個(gè)因素的影響，發(fā)現(xiàn)PAX6、MYC、ASCL1和NEUROG2能夠選擇性地誘導(dǎo)mCherry+神經(jīng)元，而SOX2、OCT4、KLF4和BDNF沒(méi)有相同的效果。這表明hGFAP啟動(dòng)子下的AAV5病毒的細(xì)胞類型特異性可以被下游因素選擇性地改變。
11. 啟動(dòng)子特異性可能由NEUROD1調(diào)節(jié)。
NEUROD1可能通過(guò)調(diào)節(jié)hGFAP啟動(dòng)子的特異性來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)元中的報(bào)告基因表達(dá)。共注射hGFAP-GFP AAV5病毒和mCh或ND1-mCh AAV5病毒的實(shí)驗(yàn)顯示，在ND1-mCh組中觀察到了許多特異性的mCherry+神經(jīng)元，但很少觀察到GFP+神經(jīng)元。這暗示NEUROD1可能在內(nèi)部調(diào)控hGFAP啟動(dòng)子的特異性。進(jìn)一步的研究表明，與對(duì)照mCh AAV5病毒相比，共同包裝的AAV-hGFAP-ND1-mCherry病毒在感染神經(jīng)元方面更有效，這進(jìn)一步支持了NEUROD1可能調(diào)節(jié)病毒包裝過(guò)程中的特異性表達(dá)。這些結(jié)果表明NEUROD1可能以順式調(diào)節(jié)的方式影響hGFAP啟動(dòng)子在內(nèi)源性神經(jīng)元中的表達(dá)特異性。
12. 誘導(dǎo)標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元不需要NEUROD1的神經(jīng)源性活動(dòng)。
研究人員通過(guò)制作NEUROD1突變體來(lái)進(jìn)一步研究其分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NEUROD1突變體失去了神經(jīng)源性活性，但仍能有效誘導(dǎo)mCherry+神經(jīng)元的產(chǎn)生。這表明NEUROD1誘導(dǎo)神經(jīng)元的能力與其神經(jīng)源性活性無(wú)關(guān)。
13. AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1既不能有效地下調(diào)PTBP1，也不能在體內(nèi)轉(zhuǎn)換紋狀體星形細(xì)胞。
研究人員調(diào)查了PTBP1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的作用。他們使用CRISPR-CasRx系統(tǒng)，將AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1病毒注射到小鼠紋狀體中，并進(jìn)行了譜系追蹤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在CasRx-Ptbp1組中，只有22.7%的mCherry+細(xì)胞表達(dá)了神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN，但沒(méi)有被YFP標(biāo)記，暗示它們不是星形細(xì)胞的后代。此外，通過(guò)免疫染色和免疫印跡驗(yàn)證，研究人員發(fā)現(xiàn)CasRx-Ptbp1病毒對(duì)PTBP1的表達(dá)僅有輕微下降。綜上所述，AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1病毒既未成功降低PTBP1的表達(dá)，也未能將紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，與之前的報(bào)道相矛盾。
14. PTBP1敲除未能在體內(nèi)轉(zhuǎn)換紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞。
基于shRNA的方法進(jìn)一步證實(shí)，沉默Ptbp1并不能將星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。無(wú)論是使用CRISPR-CasRx系統(tǒng)還是shRNA靶向Ptbp1，結(jié)果都顯示僅有少數(shù)mCherry+細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN，而這些細(xì)胞并非星形膠質(zhì)細(xì)胞的后代。因此，研究結(jié)果與之前的報(bào)道存在明顯差異，表明Ptbp1的下調(diào)對(duì)于將星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為紋狀體神經(jīng)元并不有效。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)使用了AAV-CMV-LSL-RFP和AAV-CMV-LSL-RFP-shPtbp1載體，將其注射到年輕的mGfap-Cre;R26R-YFP小鼠的紋狀體中。研究結(jié)果表明，盡管成功敲除PTBP1，常駐紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)法在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，無(wú)論是通過(guò)CRISPR-CasRx系統(tǒng)還是基于shRNA的方法。無(wú)論使用何種方法，都沒(méi)有觀察到常駐星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化，這與之前的報(bào)道形成了鮮明對(duì)比。
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研究總結(jié)
這篇文章通過(guò)遺傳譜系追蹤和逆行標(biāo)記的方法，重新審視了星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過(guò)程。結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞并不是NEUROD1誘導(dǎo)的神經(jīng)元的主要細(xì)胞來(lái)源。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，這些NEUROD1誘導(dǎo)的神經(jīng)元實(shí)際上是來(lái)源于內(nèi)源性神經(jīng)元。研究還發(fā)現(xiàn)，NEUROD1可以選擇性地改變hGFAP啟動(dòng)子的細(xì)胞特異性，但不能廣泛上調(diào)該啟動(dòng)子的表達(dá)。此外，通過(guò)PTBP1基因的沉默實(shí)驗(yàn)也未觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。總體而言，這些結(jié)果揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過(guò)程的細(xì)節(jié)，并為深入理解神經(jīng)元發(fā)生和修復(fù)提供了重要線索。