上一期我們選了一篇農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的客戶文獻(xiàn)來(lái)給大家實(shí)例講解了一下，回顧請(qǐng)戳：【修飾專欄】MCP-磷酸化修飾與非靶代謝在大豆鹽脅迫中的應(yīng)用
本期，我們從農(nóng)業(yè)領(lǐng)域轉(zhuǎn)向醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。我們選擇了一篇非常典型的文獻(xiàn)，來(lái)具體解析如何利用磷酸化修飾組定量分析，來(lái)研究疾病的機(jī)制，以及找到新的治療靶點(diǎn)。
肉瘤（sarcomas）是一種罕見(jiàn)的多樣性惡性腫瘤，多發(fā)于骨頭和結(jié)締組織。盡管針對(duì)肉瘤有手術(shù)、放療、化療等多種治療方法，但晚期肉瘤患者存活率低的情況長(zhǎng)期沒(méi)有得到改善。亟需新的、靶向的系統(tǒng)治療方案。
June 20, 2017; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-16-2550
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惡性肉瘤磷酸化蛋白組表達(dá)譜揭示ALK和MET或可作為滑膜肉瘤亞型的新型治療靶點(diǎn)
Phosphoproteomic Profiling Reveals ALK and MET as Novel Actionable Targets across Synovial Sarcoma Subtypes
Cancer Res：IF=9
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? 研究材料：20種惡性肉瘤細(xì)胞株
? 技術(shù)方法：磷酸化修飾定量蛋白質(zhì)組
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技術(shù)路線
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研究結(jié)果
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1. 樣本選擇：
經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，作者選定了20株肉瘤細(xì)胞株，并展示相關(guān)信息：
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2. 磷酸化修飾組分析：
對(duì)上述細(xì)胞株，進(jìn)行磷酸化修飾組分析。磷酸化修飾組最終一共鑒定到來(lái)源于654個(gè)蛋白的1090個(gè)酪氨酸磷酸化肽段/位點(diǎn)。
進(jìn)一步利用這些磷酸化修飾肽段的表達(dá)量進(jìn)行層次聚類分析，從下圖可以看到：這些磷酸化肽段表達(dá)可明顯區(qū)分為兩種模式——成年人和小兒，而小兒肉瘤細(xì)胞株又區(qū)分為兩個(gè)子集（可以看到磷酸化修飾的模式與疾病分類非常一致）。后續(xù)可利用生物信息學(xué)進(jìn)一步挖掘其中的重要信息：
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同時(shí)，將磷酸化修飾組結(jié)果中，最為關(guān)注的激酶數(shù)據(jù)專門(mén)挑出來(lái)，進(jìn)行進(jìn)一步整理和統(tǒng)計(jì)，可以看到不同的激酶種類、數(shù)量和樣本中的表達(dá)情況：
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3. 挑選出關(guān)鍵蛋白，進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證和初步研究
有了這么豐富的組學(xué)數(shù)據(jù)，就可以對(duì)不同細(xì)胞系的修飾組定量結(jié)果進(jìn)行比較，將其中具有顯著修飾表達(dá)差異的蛋白跳出來(lái)，后續(xù)即可圍繞其進(jìn)行深入研究，作者從中組學(xué)結(jié)果中挑選的是蛋白激酶——ALK。
首先進(jìn)行初步的驗(yàn)證和研究：
（1）驗(yàn)證ALK的修飾量是否的確發(fā)生改變：WB實(shí)驗(yàn)
（2）初步闡述ALK發(fā)生修飾變化的機(jī)制：下圖可見(jiàn)ALK基因發(fā)生了截短和重新拼接，從而使得其功能異常
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4. 對(duì)挑選出的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)行進(jìn)一步功能驗(yàn)證
（1）體外水平驗(yàn)證功能：確認(rèn)ALK抑制能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)+WB檢測(cè)ALK相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)情況：
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（2）在體水平驗(yàn)證功能：ALK/MET抑制劑藥物，能夠抑制腫瘤載荷動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)
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5. 對(duì)挑選出的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)行臨床相關(guān)研究
對(duì)43例來(lái)自于病人的腫瘤組織，進(jìn)行分析：免疫組化分析發(fā)現(xiàn)14%的腫瘤組織具有ALK高表達(dá)+FISH分析確認(rèn)ALK具有截短形式。
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6. 擴(kuò)展研究
磷酸化蛋白質(zhì)組在揭示ALK異常的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了很多其他蛋白的異常修飾變化，由此提示肉瘤可能存在多通路協(xié)同作用的機(jī)制。因此，作者采用相同的路線，進(jìn)行了擴(kuò)展研究：（1）研究了修飾組結(jié)果中的另外一個(gè)分子PDGFRα的異常修飾變化，以及進(jìn)行了相關(guān)功能的確證，證實(shí)PDGFRα也是一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)；（2）發(fā)現(xiàn)本文研究的兩個(gè)靶點(diǎn)——AKL/MET與PDGFRα的聯(lián)合干預(yù)，能夠取得更好的治療效果。
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老司機(jī)心得（必看）
該研究是利用蛋白質(zhì)翻譯后修飾，揭示新的疾病機(jī)制，尋找治療靶點(diǎn)的代表性文章，主要思路： “樣本選擇 → 磷酸化修飾組定量分析 → 篩選感興趣的蛋白，并驗(yàn)證表達(dá)變化 → 功能驗(yàn)證（細(xì)胞＆動(dòng)物） → 臨床相關(guān)分析（表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析），以及進(jìn)一步進(jìn)行了藥物聯(lián)用的探索。通過(guò)磷酸化修飾組的高通量分析篩選修飾水平發(fā)生變化的蛋白和位點(diǎn)，進(jìn)而順藤摸瓜找到關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，并確認(rèn)干預(yù)治療的效果。在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中非常值得借鑒和參考！
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老司機(jī)帶你走的更遠(yuǎn)
（1） 該文章的設(shè)計(jì)，可以說(shuō)是很完整了，發(fā)表的雜志也算是專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)的當(dāng)紅辣子雞。以該設(shè)計(jì)套路為參照，可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)成簡(jiǎn)配版和高配版。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，簡(jiǎn)配版對(duì)應(yīng)短平快地灌水低分雜志，高配版則用于沖大文章。具體怎么簡(jiǎn)配、怎么高配，后續(xù)我們會(huì)有一期專門(mén)總結(jié)套路，其中會(huì)跟大家詳細(xì)解析，敬請(qǐng)期待。感興趣的老師，可以先了解下下述的典型文獻(xiàn)：
?簡(jiǎn)配版：Quantitative cardiac phosphoproteomics profiling during ischemia-reperfusion in an immature swine model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017 Jul 1;313(1):H125-H137.（IF=3.3）
?高配版：Quantitative phosphoproteomics reveal mTORC1 activates de novo pyrimidine synthesis. Science. 2013 Mar 15;339(6125):1320-3. （IF=37.2）
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（2） 上述的分析模式，不僅適用于磷酸化修飾研究，也適用于從其他翻譯后修飾（如乙酰化、泛素化、甲基化，等等）的角度來(lái)研究生理過(guò)程、疾病或藥物機(jī)制。基本的設(shè)計(jì)套路和模式是相似的，后續(xù)我們也會(huì)有其他種類修飾的專門(mén)內(nèi)容中為大家做詳細(xì)介紹，敬請(qǐng)期待。（廣告時(shí)間：除了磷酸化，中科新生命還可提泛素化、酰化、甲基化、N糖基化等各種修飾組學(xué)分析服務(wù)）。同樣先給大家推薦一些文獻(xiàn)：
?乙酰化：SIRT3 mediates multi-tissue coupling for metabolic fuel switching. Cell Metab. 2015 Apr 7;21(4):637-46. （IF=18.1）
?泛素化：Landscape of the PARKIN-dependent ubiquitylome in response to mitochondrial depolarization. Nature. 2013 Apr 18;496(7445):372-6. （IF=40.1）；Lenalidomide Causes Selective Degradation of IKZF1 and IKZF3 in Multiple Myeloma Cells. Science. 2014 Jan 17;343(6168):301-5. （IF=37.2）