以下文章來源于RNAScript ，作者朱旭峰 于福濤
信使核糖核酸（mRNA）的5’端帽子結構（Five-prime cap）（m7GpppN）是在 1970 年代被發現的，它的存在賦予了mRNA穩定性并使其能夠有效翻譯。隨著COVID-19在全球肆虐，mRNA治療成為生物醫藥研發領域中的”新星“，我們對mRNA 5’端帽子結構的生物功能及其應用有了更深入地探索。
在真核細胞中，除了識別蛋白質合成的起始之外，5’端帽子結構還充當從5’到3’外切核酸酶切割的保護基團，同時也是募集蛋白質因子以進行前體mRNA 剪接、聚腺苷酸化和核輸出的標識符，它也充當募集起始因子的錨點。
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真核生物的mRNA加帽過程需要多種加帽酶的參與。RNA三磷酸酶（TPase）從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸，生成 5’-二磷酸 RNA（反應 1）。RNA 鳥苷酸轉移酶（GTase）通過賴氨酸-GMP 共價中間體將 GMP 基團從 GTP 轉移到 5’-二磷酸（反應 2.1 和 2.2）。嘌呤-N7 甲基轉移酶（鳥嘌呤-N7 MTase）在鳥嘌呤帽的N7胺上添加一個甲基，形成基本帽結構（Cap0）（反應 3）。
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mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，在RNA 5′末端緊鄰帽結構（Cap 0）的第一個核苷酸2′-O上添加甲基團，形成帶有 Cap 1結構的 mRNA。最近的研究表明，Cap1不僅與翻譯起始有關，在針對外源RNA的先天免疫系統中，還可作為自身RNA的標志。
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5’端帽子結構對mRNA的質量控制有著至關重要的作用。在哺乳動物細胞中，已經報道存在一種具有脫帽酶、焦磷酸水解酶和 5’ 到 3’核酸酶活性的三功能蛋白DXO/Dom3Z。該酶特異性地將未甲基化的帽子結構（GpppN）進行脫帽處理并將其降解為5’-單磷酸RNA，從而達到質量控制的目的。
5’端帽子結構有助于調節蛋白質合成。早期認為RNA加帽只發生在細胞核中，已有報道在哺乳動物細胞和錐蟲的細胞質中發現了RNA 加帽。真核細胞在P-小體中以信使核糖核蛋白（mRNP）的形式維持未加帽結構的mRNA 細胞質池，在那里可以發生 mRNA 的儲存、去腺苷酸化和脫帽。P-小體中未加帽的mRNA可以重新進入多核糖體（polysome）并被翻譯。細胞質重新加帽子結構的系統可能代表了一種新的mRNA 失活-再激活機制，有助于調節蛋白質合成。
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在病毒與固有免疫的博弈中5’端帽子結構也極為重要。因為固有免疫系統對沒有 5 ’端帽子結構的 RNA 具有較高的敏銳度，因此很多病毒進化出了豐富多樣的加帽策略。而對這些病毒mRNA的加帽機制研究，已拓展出諸如高效體外RNA 加帽系統和自擴增 mRNA 技術，大大促進了科研型與治療型 mRNA 的大規模生產。
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一些病毒加帽酶整合了RNA加帽所有必要酶活性（多功能加帽酶），以在單個多肽中生成帽結構，牛痘病毒加帽酶就是一種將7-甲基鳥苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5’末端的酶，其蛋白結構及功能域作用均被解析，通過與mRNA Cap 2’-O-甲基轉移酶的結合利用，在mRNA的體外合成與修飾中得到廣泛應用。
牛痘病毒加帽酶結構及反應過程
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病毒除了合成自身的帽子結構，也存在奪取宿主mRNA帽子結構的情況），在流感病毒（（-）ssRNA）中，依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）是三種蛋白質的復合物：聚合酶基礎蛋白1（PB1）、聚合酶基礎蛋白2（PB2）和聚合酶酸性蛋白（PA）。
在細胞核中組裝后，PB2 亞基與宿主RNA 的帽子結構結合。PA的核酸內切酶將切割宿主mRNA的含帽子結構在內的10-15個核苷酸，然后將其用于病毒的mRNA轉錄上。在酵母全病毒中Gag蛋白從宿主RNA上切割 m7GMP 基團并形成組氨酰-m7GMP共價中間體。然后將 m7GMP 基團共轉錄轉移到病毒轉錄本的 5’-二磷酸上。該過程與經典 GTase活性的相似性表明全病毒帽子結構與真核生物加帽機制之間存在進化聯系。
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病毒直接獲取宿主的帽子結構
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病毒由于其特殊的添加mRNA帽子的方式而得到關注，人們也發現其RNA加帽酶具廣泛的應用價值：
經典線性mRNA疫苗
與傳統的減毒活完整生物體相比，通過mRNA接種進行疫苗接種具有許多積極的屬性。mRNA疫苗不僅不會對載體產生免疫反應，是可以同時刺激固有免疫和體液免疫的有效手段。制造很簡單，一旦獲得致病因子的基因組序列，就可以迅速做出反應。與DNA疫苗不同，抗原產生的反應時間更快、更有效，因為mRNA疫苗可以直接在細胞質中翻譯。也無需擔心潛在的基因組整合。
自擴增mRNA
利用甲病毒的RNA轉錄加帽裝置，已開發出一種自擴增mRNA 技術作為疫苗接種的原位基因表達載體。甲病毒有一個（+）ssRNA 基因組，編碼非結構性前體蛋白nsp1-4，用于RNA依賴性RNA復制、轉錄和加帽，以及兩個衣殼蛋白E2和E1。
通過用目標基因替換衣殼蛋白基因，加帽和聚腺苷酸化的自擴增RNA 構建體在引發免疫反應方面比通過標準mRNA接種疫苗更有效，并且已經在動物模型中證明有效。
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Cappable-Seq RNA測序
痘病毒加帽酶能夠使用3’修飾的GTP為RNA添加帽子結構。從而出現了一種基于這種功能的從生物樣品中富集和測定5’-三磷酸RNA 種類的新方法。稱為Cappable-seq，痘病毒加帽酶用于使用3’-脫硫生物素GTP 將生物樣品中RNA的5’-三磷酸或二磷酸末端加帽。然后可以對脫硫生物素化的加帽RNA進行富集和深度測序。
Cappable-seq實現了50倍于初級轉錄本的富集，并在大腸桿菌中以單堿基分辨率在全基因組范圍內識別了以前未報告的轉錄起始位點（TSS）。該方法還被應用于從小鼠盲腸樣本中鑒定微生物組轉錄組，并首次在微生物組中鑒定出TSS。
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近岸蛋白提供GMP級mRNA體外合成及修飾用酶，其中牛痘病毒加帽酶和mRNA Cap 2’-O-甲基轉移酶，加帽效率近100%
近岸蛋白mRNA疫苗藥物原料酶及試劑
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? 產品名稱 |
| GMP-RE026 | BsaI |
| M082 | Cap1 Capping System |
| MR008 | eGFP mRNA |
| MR009 | Luciferase mRNA |
| PA007 | mRNA Enzymes DIBA Kit |
| E135 | Thermostable T7 RNA Polymerase |
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參考文獻: Ramanathan, A., Robb, G. B., & Chan, S. H. (2016). mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 44(16), 7511–7526. Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。 |
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