果實(shí)成熟是一個(gè)有序而復(fù)雜的過(guò)程，了解果實(shí)成熟機(jī)制，不僅可以了解如何保持果實(shí)品質(zhì)，而且可以指導(dǎo)延長(zhǎng)貯藏期的方式，已有研究表明多種翻譯后修飾和動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄重編程均參與果實(shí)成熟調(diào)控，但翻譯后修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控在果實(shí)成熟過(guò)程中的相互關(guān)系尚不清楚。 2021年11月，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)陸旺金教授和陳建業(yè)教授課題組在植物學(xué)Top期刊Plant Physiology（IF 8.34）發(fā)表了題為“Phosphorylation of transcription factor bZIP21 by MAP kinase MPK6-3 enhances banana fruit ripening”的研究論文。文章利用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子MabZIP21在果實(shí)成熟過(guò)程中的重要作用，揭示了MabZIP21影響香蕉果實(shí)成熟的具體分子機(jī)制。中科新生命提供了磷酸化修飾蛋白組學(xué)技術(shù)支持服務(wù)。 研究材料 未成熟香蕉、成熟香蕉（自然成熟、乙烯催熟、1-MCP延緩成熟）
技術(shù)路線
步驟1：磷酸化修飾蛋白組學(xué)結(jié)果分析；
步驟2：MabZIP21下游靶向基因篩選；
步驟3：MabZIP21相互作用蛋白的確定及功能驗(yàn)證；
步驟4：MabZIP21主要磷酸化修飾位點(diǎn)的確定及其功能驗(yàn)證；
步驟5：MabZIP21的反饋調(diào)節(jié)。
研究結(jié)果
1. 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示MabZIP21磷酸化參與香蕉果實(shí)的成熟
作者使用未成熟和成熟的香蕉（乙烯誘導(dǎo)成熟）組織樣本進(jìn)行磷酸化蛋白組學(xué)分析，共鑒定到63條在果實(shí)成熟過(guò)程中差異化表達(dá)的磷酸化肽段（對(duì)應(yīng)49個(gè)蛋白）（圖1），其中轉(zhuǎn)錄因子MabZIP21 (Ma04_p35070)的磷酸化水平變化最大。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MabZIP21在自然成熟、乙烯催熟和1-MCP延緩成熟三種果肉中的轉(zhuǎn)錄本水平均顯著增加，并在成熟階段達(dá)到最高水平（圖2A）,其磷酸化水平在成熟果實(shí)中遠(yuǎn)高于未成熟果實(shí)（圖2D和2E）。
圖1 成熟果實(shí)中的磷酸化蛋白組學(xué)分析
圖2 成熟果實(shí)中MabZIP21轉(zhuǎn)錄本和磷酸化水平的變化
2. MabZIP21參與調(diào)控多種成熟相關(guān)基因
為了深入了解MabZIP21控制香蕉成熟的機(jī)制，作者利用DAP-Seq等技術(shù)尋找MabZIP21的下游結(jié)合基因（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)MabZIP21可直接結(jié)合多種成熟相關(guān)的基因（比如MaACO1,MaPG3,MaPL5,MaPL15,MaPE42,MaPE51,MaEXPA15）并激活它們的轉(zhuǎn)錄，證明了MabZIP21參與香蕉的成熟過(guò)程（圖4）。
圖3 MabZIP21靶向基因的篩選
圖4 MabZIP21與香蕉成熟相關(guān)基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合
3. MabZIP21相互作用蛋白的確定及其功能驗(yàn)證
磷酸化組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MabZIP21的磷酸化水平發(fā)生了明顯的改變且MAPK激酶（相較于其他激酶）更多的參與了成熟香蕉組織中磷酸化水平的變化（圖1D），后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MaMPK6-3（MAPK激酶的一種）可直接與MabZIP21結(jié)合（圖5A、5B和5D），并增強(qiáng)了MabZIP21的轉(zhuǎn)錄激活能力（5E）。另外研究還發(fā)現(xiàn)MabZIP21在基因調(diào)控中可以形成同源二聚體（圖5B和5D）。
將MaMPK6-3瞬轉(zhuǎn)至香蕉中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MaMPK6-3過(guò)表達(dá)的香蕉成熟的更快（圖6B和6C），且磷酸化蛋白的含量更高（圖6D和6E），證明了MaMPK6-3在香蕉成熟和蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
圖5 MabZIP21與自身及MaMPK6-3相結(jié)合
圖6 MaMPK6-3的過(guò)表達(dá)促進(jìn)香蕉成熟、提高磷酸化蛋白含量
4. MabZIP21被MaMPK6-3磷酸化的主要位點(diǎn)確定及其功能驗(yàn)證
為確定MabZIP21的磷酸化修飾位點(diǎn)，作者采用Phos-tag SDS-PAGE結(jié)合LC-MS/MS的方式進(jìn)行分析，結(jié)果表明Ser436和Thr318是MabZIP21上的磷酸化位點(diǎn)（圖7A和7B）。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ser436和Thr318的突變會(huì)影響MaMPK6-3對(duì)MabZIP21的磷酸化修飾（圖7C和7D）、MabZIP21與MaMPK6-3的結(jié)合（圖7E和7F）、MabZIP21的轉(zhuǎn)錄激活活性（圖8A）、MabZIP21與下游成熟相關(guān)基因的結(jié)合能力（圖8B-8D），以及影響果實(shí)的成熟速度（圖9C-9E）和MabZIP21下游成熟相關(guān)基因的表達(dá)水平（圖9F）。
圖7 MabZIP21磷酸化位點(diǎn)的鑒定
圖8 Ser436和Thr318磷酸化對(duì)MabZIP21活性的影響
圖9 Ser436和Thr318磷酸化對(duì)香蕉果實(shí)成熟的影響
5. MabZIP21激活MaMPK6-3及其自身的轉(zhuǎn)錄
轉(zhuǎn)錄因子通常通過(guò)形成反饋調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄。本研究證實(shí)MabZIP21可與MabZIP21和MaMPK6-3的啟動(dòng)子結(jié)合并正向調(diào)控他們的表達(dá)(圖10)。
圖10 MabZIP21調(diào)控MaMPK6-3及其自身的轉(zhuǎn)錄
小結(jié)
磷酸化蛋白組學(xué)技術(shù)助力揭示磷酸化修飾的MabZIP21在采后香蕉果實(shí)成熟衰老過(guò)程中的新機(jī)制，該研究成果為改善果蔬貯運(yùn)品質(zhì)和制定合理的保鮮物流措施提供了理論支撐。
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