光的吸收導致染料分子進入電子激發(fā)態(tài)。吸收的能量僅儲存很短的時間，并且可以在激發(fā)態(tài)壽命結(jié)束后再次輻射，例如作為熒光。
在染料溶液中，被激發(fā)的染料分子可以被視為電偶極子或振蕩器，如果它們之間的距離足夠大，則它們不會相互影響。
當發(fā)色團之間的平均距離約為5-10nm時，振蕩器的“輻射場”才產(chǎn)生影響。兩種染料分子之間的這種相互作用可以通過福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）模型來描述。
如果發(fā)色團之間的距離變得更小，例如在非常濃縮的溶液中，則各個振蕩器可以通過靜電相互作用強烈地相互影響。由于單個染料分子的分子間相互作用，這種燃料溶液的吸收和熒光行為都會發(fā)生強烈變化。
水中的羅丹明6G
濃縮的羅丹明6G水溶液的UV/Vis光譜顯示主吸收帶的短波側(cè)翼有一個肩部。通過稀釋溶液并增加比色皿的光程（d）來改變濃度（c）以彌補稀釋，即根據(jù)朗伯-比爾定律總是期望相同的吸光度，可以觀察到以下光譜：
等吸光點的出現(xiàn) - 所有相關(guān)物質(zhì)的濃度變化是線性的，dE/dc = 0，表明兩種（或更多）物質(zhì)彼此處于動態(tài)平衡。
解離或締合/絡(luò)合常數(shù)可以通過實驗確定：在稀釋系列中，溶液的稀釋始終通過光程的變化進行補償，“有效消光系數(shù)”可以通過在（單體）最大，了解稀釋因子和初始樣品濃度。該樣品濃度是根據(jù)不發(fā)生二聚化的非常稀釋的溶液的紫外光譜確定的。由于朗伯-比爾定律中不同物種的吸收表現(xiàn)相加，因此可以通過了解基礎(chǔ)反應來寫出有效消光或有效消光系數(shù)。通過解離常數(shù)的參數(shù)變化和圖形分析，獲得一條直線，從其斜率和軸截面可以確定單體和二聚體的消光系數(shù)。
疏水相互作用
有機染料的聚集尤其發(fā)生在水或高離子強度的溶劑中。主要原因是分子間范德華力，即所謂的“疏水相互作用”。親脂性染料分子通過使水合物殼具有盡可能小的表面積來試圖避開親水性水分子。這種現(xiàn)象也是導致染料吸附在玻璃表面或與基材分子非特異性結(jié)合的原因。
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形成二聚體或更高聚集體的趨勢取決于
?-染料的濃度- 濃度越高，聚集越大
-溶劑- 在水或甲醇中，與乙醇或其他有機溶劑不同，可以更頻繁地觀察到聚集。通過比較ATTO 565在PBS緩沖液（pH 7.4）和乙醇與三氟乙酸 (TFAc) 中的等濃度溶液的吸收光譜，令人印象深刻地證明了這一點：
-存在的任何電解質(zhì)（鹽），尤其是在氯仿等有機溶劑中形成離子對（染料陽離子和抗衡離子）時
-溫度- 在較高溫度下，熱運動使聚集更加困難
-染料的分子結(jié)構(gòu)- 染料與疏水性更強的染料（例如ATTO Rho6G、ATTO Rho11、ATTO Rho12等）相比，親水基團（例如ATTO 488?、?ATTO 532?、ATTO?542等）在水溶液中不會發(fā)生聚集：
由于這是動態(tài)平衡，因此可以通過稀釋溶液將二聚體重新轉(zhuǎn)化為單體。當測量的吸收光譜不隨著進一步稀釋和光路的相應增加而改變時，就達到了“單體光譜”。對于大多數(shù)疏水性ATTO染料，吸光度約為0.04。
蛋白質(zhì)綴合物中的分子內(nèi)相互作用/DOL測定
染料NHS酯與蛋白質(zhì)氨基的反應可能會產(chǎn)生染料綴合物，其中共價結(jié)合的染料分子緊密相鄰并且可以彼此相互作用。這可能會導致吸收光譜發(fā)生強烈變化，如ATTO 565階梯親和素綴合物的示例所示：
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在綴合物光譜中，觀察到附加的短波吸收帶，類似于濃度足夠高的染料水溶液。由于這是共價結(jié)合的染料分子的分子內(nèi)相互作用，因此當綴合物溶液稀釋時，吸收光譜不會改變！
聚集體有兩種主要類型：
H聚集體（H = hypsochrome）
當兩個或多個染料分子以其躍遷偶極矩定位時（通常沿著S0?-S1中發(fā)色系統(tǒng)的縱軸），就會發(fā)生這種類型的聚集。過渡）彼此平行。與單體吸收相反，觀察到吸色偏移的吸收帶。?由于空間接近，電子軌道相互影響，兩個分子必須被視為一個整體。能級被分開，量子力學規(guī)則允許的吸收具有更高的能量，因此發(fā)生在更短的波長處。從這種能量較高的激發(fā)態(tài)開始，會發(fā)生快速的內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC），因此不再可能產(chǎn)生熒光。
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J聚集體（根據(jù)EE Jelley）
?這種類型的聚集會導致吸收帶的長波偏移，這與能帶半寬度的顯著減小有關(guān)。
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?J聚集體通常存在于聚次甲基染料中，例如花青、部花青或類似的發(fā)色團。Jelley和Scheibe首次在假異花青染料上獨立觀察到了這一現(xiàn)象。
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對于由單個染料組合而成的 "超分子聚合物"，人們提出了不同類型的模型描述。對分子關(guān)系最簡單的描述是，單個分子一前一后排列，因此過渡偶極矩也是一致的。分子的集體考慮導致能級分裂： 量子力學允許的轉(zhuǎn)變現(xiàn)在能量較低，這就解釋了吸收帶的長波偏移。
聚集會受到溶劑組成、鹽或添加劑的添加以及染料濃度的強烈影響。在理想條件下，可以在紫外/可見光譜中觀察到極窄的吸收帶。與H聚集體相反，這種類型的聚集體可以發(fā)出熒光，尤其是在較低溫度下：然而，非常窄的發(fā)射帶的最大值相對于吸收最大值僅紅移幾納米。
根據(jù)實驗條件，文獻中報道了吸收帶的“加寬”，這可以通過包含J聚集體的禁電子轉(zhuǎn)移來解釋。
ATTO 488標記磷脂
ATTO 488標記的磷脂在氯仿中的溶液首先會呈現(xiàn)出意想不到的顏色： 未稀釋的該溶液不是淺黃色和明亮的綠色熒光，而是呈現(xiàn)粉紅色至洋紅色。這種長波偏移吸收可以用J聚合物的存在來解釋。當用甲醇稀釋該溶液時，顏色會變?yōu)辄S色，并發(fā)出強烈的熒光。通過改變?nèi)軇┏煞郑奂w就會減少。下圖顯示了ATTO 488標記的1,2-雙(二苯基膦)乙烷（DPPE）在純氯仿和在氯仿/甲醇（8:2，V/V）混合溶劑中的兩種溶液的情況：
左邊顯示的是兩種溶液在正常日光下的情況。右圖中，與甲醇混合的溶液在紫外線（366納米）照射下發(fā)出的綠色熒光特別明顯。
參考文獻
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