什么是rhPCR？
rhPCR（RNase H-dependent PCR）即依賴于RNase HII的PCR，在PCR的基礎(chǔ)上增加了RNase HII和封閉式可切割rhPCR引物。rhPCR利用了RNase HII的特殊性質(zhì)，即可以特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA，但不能水解單鏈或雙鏈DNA或RNA中的磷酸二酯鍵，不能消化單鏈或雙鏈DNA或RNA。因此只有當(dāng)互補靶DNA堿基存在時，RNase HII才能消化DNA-RNA雜交鏈從而允許引物延伸。由于僅在與互補靶序列緊密結(jié)合時才發(fā)生rhPCR引物的裂解切割，故極大地提高了反應(yīng)的準(zhǔn)確性。rhPCR因其特異性和靈敏度，在單核苷酸多態(tài)性（SNP）、基因分型、多靶標(biāo)同時檢測、環(huán)境核酸檢測等方面具有一定的優(yōu)勢。
技術(shù)路線
01
引物設(shè)計
引物設(shè)計要確保切割后熔化溫度高于退火溫度，以保證引物在PCR循環(huán)中穩(wěn)定結(jié)合模板，rhPCR引物由3個部分構(gòu)成：
1） 5' DNA片段：在長度和熔化溫度（Tm）要求上與標(biāo)準(zhǔn)PCR引物相當(dāng)，經(jīng)過RNase HII酶的切割后，能夠與模板DNA有效配對并進行延伸。
2） 單個RNA堿基，為RNase-HII提供切割位點。
3） 3' DNA片段：帶有一個阻斷劑的四或五個堿基長度，通常是一個短的，不可延伸的分子，例如丙二醇，可以阻止DNA聚合酶的延伸，直到該阻斷被移除。
02
切割與延伸
在rhPCR反應(yīng)開始時，引物和模板DNA是游離的。當(dāng)引物與特定的RNA:DNA異源雙鏈模板結(jié)合后，封閉引物的RNA 堿基5'-側(cè)被RNase HⅡ酶識別并切割，留下一個帶有3'-羥基的DNA寡核苷酸，為DNA聚合酶提供延伸的起點。
圖1. rhPCR原理圖[1]
翌圣RNase HⅡ
翌圣的RNase HⅡ（Cat#14539）來源于深淵熱球菌 (Pyrococcus abyssi, P.a.)，無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留，低宿主殘留，有效減少體系假陽性。翌圣RNase HⅡ極度耐熱，95°C反應(yīng)30 min后，仍保持活性，可與rhPCR各反應(yīng)體系兼容，也適用于LAMP等。
01
E. coli基因組DNA殘留< 0.5 copies/100 U
對不同批次的RNase HⅡ進行E. coli基因組DNA殘留檢測，結(jié)果顯示翌圣RNase HⅡ宿主基因組DNA殘留遠(yuǎn)低于0.5 copies/100 U。
圖2. E. coli基因組DNA殘留檢測
02
95℃耐熱性測試
對翌圣RNase HⅡ進行95℃加熱0~45 min后，測試RNase HⅡ的酶活結(jié)果，結(jié)果表明翌圣RNase HⅡ加熱45 min后，酶活幾乎沒有損失。
圖3. 95℃耐熱測試
03
無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留（1 U投入量）
將1 U 不同批次的RNase HⅡ分別與相應(yīng)的底物DNA/RNA在37℃孵育4 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明，RNase HⅡ無核酸外切酶、切口酶、RNase殘留。
圖4. 核酸外切酶、切口酶、RNase殘留檢測結(jié)果
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產(chǎn)品應(yīng)用 |
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產(chǎn)品貨號 |
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rhPCR、LAMP |
RNase HII(2 U/μL) |
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rhPCR |
Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL |
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RT-LAMP |
Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL) |
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Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶 |