非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球慢性肝病的主要原因，然而，目前還沒有治療方法或藥物能夠阻止或逆轉(zhuǎn)脂肪肝。隨著病情的進(jìn)展，患者會出現(xiàn)不可逆肝損傷，甚至可能需要肝移植。由于缺乏研究模型，NAFLD防治方法的研究面臨很大挑戰(zhàn)。
今天我們特別關(guān)注一篇在NAFLD領(lǐng)域的最新研究成果——《Engineered human hepatocyte organoids enable CRISPR-based target discovery and drug screening for steatosis》，該研究團(tuán)隊(duì)通過多種技術(shù)手段構(gòu)建了NAFLD類器官模型來研究NAFLD進(jìn)展的不同因素，并且成功發(fā)現(xiàn)FADS2基因是一個(gè)新的與NAFLD相關(guān)的關(guān)鍵基因，為后續(xù)治療提供了一個(gè)新的起點(diǎn)。
一、研究背景
全球約有1/4的人口深受非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）影響[1]。NAFLD是一種進(jìn)行性疾病。從肝臟內(nèi)脂肪堆積開始，即肝臟脂肪變性，可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），最終導(dǎo)致肝衰竭或癌癥[2,3]。盡管NAFLD的患病率很高，并且還在不斷上升，但任何階段的NAFLD都缺乏有效的藥物治療[4,5]。
在已有的研究中，NAFLD生物學(xué)和假定的藥物治療主要以嚙齒類動物為模型進(jìn)行研究[6]。但固有的物種間差異，削弱了研究結(jié)果與人體的對應(yīng)性。依賴原代細(xì)胞或多能干細(xì)胞衍生細(xì)胞的相關(guān)體外人NAFLD模型已經(jīng)出現(xiàn)[7-9]，但其對高通量藥物篩選的適用性仍未得到證實(shí)。本文使用人胎兒肝細(xì)胞構(gòu)建類器官模型，在此模型的基礎(chǔ)上建立了基于CRISPR的篩選平臺，稱為FatTracer，并且成功篩選到關(guān)鍵的靶點(diǎn)FADS2基因，有助于更好的了解以及治療NAFLD。
二、主要研究結(jié)果
1. 建立類器官疾病模型模擬不同機(jī)制的脂肪變性
構(gòu)建三種不同肝臟類器官以模擬不同的脂肪變性觸發(fā)因素，分別是：（1）游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的脂肪變性類器官模型，用以研究飲食導(dǎo)致的脂肪變性；（2）編輯PNPLA3基因誘導(dǎo)的個(gè)體遺傳敏感性類器官模型，用以研究個(gè)體遺傳敏感性差異導(dǎo)致的脂肪變性；（3）編輯APOB或MTTP基因誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝障礙類器官模型，用以研究脂質(zhì)代謝障礙所致的脂肪變性。
（1）添加低濃度的FFA（＜80 μM），類器官能夠正常代謝，不會形成甘油三酯沉積，添加較高濃度FFA（＞80 μM），類器官中出現(xiàn)甘油三酯積累，提示出現(xiàn)脂肪變性。最高濃度FFA添加后（640 μM），統(tǒng)計(jì)類器官的脂肪變性比率約40%，且類器官的增殖能力受損；
（2）PNPLA3基因中編碼I148M變異的rs738409變異是已見報(bào)道的與NAFLD相關(guān)性最強(qiáng)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素[10]。作者利用CRISPR方法在類器官中引入I148M變體，生成雜合子（PNPLA3WT/I148M）和純合子（PNPLA3I148M/I148M）變體類器官，同時(shí)使用引入空載體但未編輯的類器官（PNPLA3WT）作為內(nèi)部對照，還對PNPLA3進(jìn)行了敲除（PNPLA3?/?）。 PNPLA3WT類器官在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下不會出現(xiàn)脂肪沉積。但是三個(gè)編輯過PNPLA3基因型的類器官都自發(fā)產(chǎn)生了脂肪沉積。PNPLA3?/?類器官積累脂肪最多（約8%脂肪變性），其次是I148M純合子類器官（約5%）和雜合子I148M類器官（約2%）；
（3）建立兩種易導(dǎo)致NAFLD的單基因脂質(zhì)疾病模型：家族性低β脂蛋白血癥和無β脂蛋白血癥。這些疾病最常見的原因單等位基因或更罕見的雙等位基因缺失（家族性低β脂蛋白血癥缺失APOB，無β脂蛋白血癥缺失MTTP），由此產(chǎn)生的極低密度脂蛋白（VLDL）分泌受損，反過來又會導(dǎo)致脂肪變性。作者首先證實(shí)野生型類器官主動分泌VLDL顆粒，從而不會積累起甘油三酯。然后，作者對野生型類器官進(jìn)行基因編輯，構(gòu)建了APOB和MTTP雙等位基因缺失的類器官模型，通過脂質(zhì)含量的定量、葡萄糖同位素示蹤實(shí)驗(yàn)，表明由于糖源性脂肪的積累，肝臟類器官自發(fā)出現(xiàn)脂肪沉積，導(dǎo)致脂肪變性，成功構(gòu)建了遺傳性脂肪變性肝臟類器官。
圖1 構(gòu)建不同機(jī)制的肝臟類器官模型
圖2 建立脂質(zhì)代謝障礙類器官模型并探究機(jī)制
2. 篩選通過減少脂肪變性治療NAFLD的藥物
上述開發(fā)的模型可以搭建藥物篩選平臺，以識別直接作用于肝細(xì)胞以減少脂肪變性、治療NAFLD的藥物。作者將FFA誘導(dǎo)的模型和脂質(zhì)代謝障礙模型暴露在多種候選藥物中，通過尼羅紅染色評估脂肪沉積，開發(fā)出脂滴評分系統(tǒng)來評價(jià)藥物有效性。并對遺傳易感性模型添加FFA，誘導(dǎo)飲食導(dǎo)致的脂肪變性模型，再利用篩選出的幾種有治療效果的藥物進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)治療效果在遺傳敏感性模型上被削弱。
研究還在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平上研究了藥物反應(yīng)和作用，以評估藥物機(jī)制和整體細(xì)胞反應(yīng)（包括不良反應(yīng)），RNA-seq顯示，在可以同等減少脂肪變性的所有不同藥物的處理下，差異基因表達(dá)分析存在明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對NAFLD有效的藥物通過一個(gè)共同的機(jī)制起作用，即阻止糖生成脂類。該研究還觀察到，NAFLD高風(fēng)險(xiǎn)突變的類器官（PNPLA3I148M/I148M）與沒有突變的類器官（PNPLA3WT）對所有藥物的應(yīng)答方式不同，這表明類器官可以作為個(gè)性化醫(yī)療的工具。
圖3 基于類器官模型的藥物篩選
3. 建立FatTracer平臺
研究人員利用突變體，對潛在的脂肪變性調(diào)節(jié)劑和可能的藥物靶點(diǎn)進(jìn)行基于CRISPR的遺傳篩選，并將這個(gè)平臺命名為FatTracer。受到藥物篩選中出現(xiàn)的非常特定的靶點(diǎn)依賴性的啟發(fā)，對35個(gè)與脂質(zhì)代謝和NAFLD有關(guān)的候選基因進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)FADS2基因（編碼脂肪酸去飽和酶2）是一個(gè)未見報(bào)道的、與NAFLD疾病相關(guān)的關(guān)鍵基因，F(xiàn)ADS2基因的缺失使得類器官中的脂肪含量大大增加，F(xiàn)ADS2過表達(dá)顯著降低了脂肪沉積的程度。因此，F(xiàn)ADS2表達(dá)水平的調(diào)節(jié)直接決定了肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性的水平，無論是發(fā)展中的脂肪變性還是已經(jīng)存在的脂肪變性，表明FADS2是治療NAFLD的一個(gè)新的有效治療靶點(diǎn)。
圖4 FatTracer篩選平臺
三、編者點(diǎn)評
這是一項(xiàng)非常先進(jìn)的類器官研究，并且與深受NAFLD困擾的患者息息相關(guān)。本篇文章捕獲了一個(gè)新的關(guān)鍵性基因FADS2，是治療NAFLD的一個(gè)新的有效治療靶點(diǎn)，可能會對這一種困擾世界1/4人口的疾病有突破性的進(jìn)展。
此外，本文提供了一種類器官技術(shù)的運(yùn)用新思路，即通過基因編輯構(gòu)建非腫瘤疾病的類器官模型，用于毒理藥理研究、功效評價(jià)等，豐富了體外模型的種類，并且可以解決動物模型與人體對應(yīng)性不佳的問題。
作為斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和精準(zhǔn)醫(yī)療三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特類器官平臺正致力于開發(fā)基于基因編輯技術(shù)的多種非腫瘤疾病的類器官模型，未來將為食品、藥品、化妝品等行業(yè)提供更多精準(zhǔn)評價(jià)與機(jī)制研究模型，敬請期待！
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