近幾年，單細(xì)胞技術(shù)無論在發(fā)展還是在需求上均呈現(xiàn)“井噴之勢”。因?yàn)閭鹘y(tǒng)研究往往是針對大量細(xì)胞分析得到的平均結(jié)果，掩蓋了單個(gè)細(xì)胞的差異，無法捕捉單細(xì)胞層面更精細(xì)的變化。因此，在單細(xì)胞水平解析復(fù)雜多樣的細(xì)胞圖譜已經(jīng)成為重要方向。尤其在癌癥、免疫、發(fā)育、進(jìn)化等研究方向上，揭示細(xì)胞異質(zhì)性變化已成為當(dāng)下熱點(diǎn)和機(jī)遇。
目前，單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已較為成熟，但蛋白層面發(fā)展非常有限。這是因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)一般不足200pg，且復(fù)雜程度更高，因此對質(zhì)譜技術(shù)提出了更高的要求。總的來說，利用質(zhì)譜進(jìn)行單細(xì)胞水平蛋白質(zhì)組分析主要面臨著三大挑戰(zhàn)：1）有效的將肽段傳輸?shù)劫|(zhì)譜檢測器中；2）肽段序列的鑒定；3）提高檢測通量。
針對單細(xì)胞蛋白質(zhì)組面臨的挑戰(zhàn)，來自美國東北大學(xué)的Nikolai Slavov團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)了SCoPE-MS及SCoPE2技術(shù)，并在“Single-cell protein analysis by mass spectrometry”中進(jìn)行了詳細(xì)闡述，該技術(shù)優(yōu)化了6大解決方案，再次提升蛋白質(zhì)組鑒定能力，使得單細(xì)胞蛋白質(zhì)組之夢咫尺可及，為細(xì)胞異質(zhì)性研究的突破帶來無限可能。
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Solution 1
SCoPE-MS引入了一個(gè)同位素載體的概念，利用TMT標(biāo)記低豐度的目標(biāo)樣本以及一個(gè)相對高豐度的載體樣本，混合后上機(jī)檢測。TMT標(biāo)記使得單細(xì)胞的肽段序列和和bulk樣本具體相同的質(zhì)荷比，碎裂后通過報(bào)告離子進(jìn)行相對定量。這種方式有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一、吸附損失會(huì)按比例主要影響載體樣本，從而減少微量樣本的損失；二、載體蛋白組可以提供肽段碎片，從而可以提高肽段序列鑒定能力；三、TMT可以同時(shí)檢測多個(gè)樣本，提高檢測通量。
值得注意的是，由于載體只能減少損失和提高肽段序列的鑒定，而不能放大或提高信號(hào)離子的強(qiáng)度。因此，最重要的是將更多的肽段傳輸?shù)劫|(zhì)譜中，才能支撐起更可靠的定量分析。
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Solution 2
常規(guī)的細(xì)胞裂解會(huì)使用去垢劑或其他一些化學(xué)試劑，不去除干凈會(huì)影響蛋白酶解和質(zhì)譜分析。但去除化學(xué)試劑這個(gè)過程會(huì)損失樣本的同時(shí)，還會(huì)增加實(shí)驗(yàn)流程的復(fù)雜性。自適應(yīng)聚焦聲波（AFA）是一個(gè)天然的提取蛋白的方法，不會(huì)引入質(zhì)譜不兼容的試劑，當(dāng)然，要注意的是其要求樣本體積在10ul以上，且需較高的自動(dòng)化設(shè)備成本。
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Solution 3
前處理第二代方法——迷你蛋白質(zhì)組學(xué)樣本準(zhǔn)備儀（mPOP），利用的是冷凍-熱循環(huán)系統(tǒng)將蛋白傳輸至質(zhì)譜系統(tǒng)，并將樣本體積減少了十倍且成本低廉。樣本體積的減少降低了試劑的使用量，也減小了試劑與樣本接觸的表面積，從而減少了樣本損失的可能性。
更進(jìn)一步的，僅需要幾百納升的nanoPOTS、OAD，以及iPAD1的方法被發(fā)明了。SCoPE-MS就是采用了nanoPOTS。此時(shí)面臨的難點(diǎn)在于納升級別的樣本進(jìn)樣需要手動(dòng)操作。因此，想要充分利用微型細(xì)胞裂解和樣品制備需要進(jìn)一步微型化所有其他分析步驟，包括高效且自動(dòng)地將小樣品裝載到色譜柱上。
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Solution 4
LC-MS/MS參數(shù)的優(yōu)化可以提高鑒定到的肽段數(shù)以及定量的準(zhǔn)確性，尤其是對于單細(xì)胞組學(xué)這樣的極微量的樣本，任何一點(diǎn)污染物或是離子傳輸過程的損失都會(huì)嚴(yán)重?fù)p害數(shù)據(jù)質(zhì)量。作者團(tuán)隊(duì)開發(fā)了優(yōu)化LC-MS/MS參數(shù)的模塊化和交互式工具DO-MS。DO-MS通過對肽段分離和掃描，到譜圖匹配等各個(gè)階段的數(shù)據(jù)進(jìn)行交互式可視化來診斷分析中的問題，是SCoPE2的一個(gè)主要組成部分。其一大優(yōu)勢在于可以顯示肽段洗脫時(shí)距離峰值的時(shí)間偏移以及肽段進(jìn)入二級質(zhì)譜分析的時(shí)間。這些數(shù)據(jù)可以使得我們可以合理的糾正系統(tǒng)性誤差，選擇最佳的質(zhì)譜參數(shù)，從而最大化進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜分析的肽的比例或者能夠盡量使提取的位置接近肽的峰值。
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Solution 5
肽段的豐度可以基于單個(gè)質(zhì)荷比的峰計(jì)算，但是序列的確定則需要多個(gè)片段離子。因此低豐度的肽段容易定量，但序列的鑒定卻很難。為了克服這個(gè)困難，通常會(huì)用到所有特征性的信息對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，比如肽段的保留時(shí)間和離子淌度。但數(shù)據(jù)過濾的方法也是無法改善假陽性率的，于是研究團(tuán)隊(duì)將貝葉斯框架和保留時(shí)間結(jié)合在一起，開發(fā)了一種數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的校準(zhǔn)保留時(shí)間的方法（DART-ID）。該方法在FDR設(shè)定為1%的條件下，將識(shí)別到的肽段的數(shù)量提升了50%。
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Solution 6 優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，提高肽段的分離度
尖銳的洗脫峰和低流速可以盡可能多的將肽段傳輸至質(zhì)譜檢測器，這可以通過毛細(xì)管電泳、高靈敏度的多為色譜策略，以及使用整體的納米毛細(xì)管色譜柱，PLOT色譜柱、小孔徑的色譜柱，還有降低流速等實(shí)現(xiàn)。
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中科新生命
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組技術(shù)使得蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)入了一個(gè)極微量樣本的時(shí)代，可以應(yīng)用于稀有細(xì)胞、處于不同分化階段的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分析，對于組織亞結(jié)構(gòu)研究、胚胎發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性、CTC細(xì)胞、干細(xì)胞分化和神經(jīng)研究等提供重要的生物學(xué)意義。中科新生命緊跟技術(shù)前沿，即將推出單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)，敬請期待！