前言
細(xì)胞是生命活動的基本單元。對細(xì)胞的精確認(rèn)知是理解細(xì)胞在生理和病理過程中功能的先決條件。
在組織、器官或個體中，細(xì)胞具有非常大的異質(zhì)性，而傳統(tǒng)的研究手段針對大量細(xì)胞進(jìn)行分析，得到的是大量細(xì)胞的平均結(jié)果，無法區(qū)分不同細(xì)胞個體對于大量樣品結(jié)果的具體貢獻(xiàn)值，從而忽視或掩蓋了單細(xì)胞的個體差異，不能完全捕捉細(xì)胞的復(fù)雜性、多樣性以及功能的不同。
因此非常有必要開發(fā)新技術(shù)在單細(xì)胞水平揭示細(xì)胞異質(zhì)性，目前對單細(xì)胞技術(shù)的需求越來越高。
PART01
二代測序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展使對單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究突飛猛進(jìn)，科學(xué)家們對細(xì)胞認(rèn)識的分辨率大大提高，然而單細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對描述細(xì)胞在生物體復(fù)雜環(huán)境中的表型和功能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而蛋白質(zhì)作為細(xì)胞內(nèi)所有功能的直接執(zhí)行者，細(xì)胞通過蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾，可以感知并響應(yīng)幾乎所有外在和內(nèi)在的刺激，從而影響整個生命體的功能和狀態(tài)。
因此，對單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的定性和定量分析，是揭示細(xì)胞類型及其狀態(tài)的必不可少工具，在腫瘤異質(zhì)性、干細(xì)胞分化、生殖細(xì)胞發(fā)育、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等重要領(lǐng)域有著不可或缺的應(yīng)用價值。
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的目的就是為了實(shí)現(xiàn)對單個細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成的定性和定量分析，從而獲得不同細(xì)胞個體蛋白組的定性和定量差異，構(gòu)建精細(xì)蛋白分子圖譜，從根本上揭示不同細(xì)胞個體之間的類型及其狀態(tài)的差異，使科研工作者可以更好地了解細(xì)胞及其表型和生命活動。
PART02
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的難點(diǎn)和瓶頸主要在于單細(xì)胞內(nèi)極其微量的蛋白質(zhì)，一般單個細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總量僅不到200 pg，而其又是由上萬種不同種類的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)以極高的動態(tài)范圍、不同的拷貝數(shù)存在于一個單獨(dú)的細(xì)胞中。
直接對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)鑒定分析，在其樣品前處理、分離和質(zhì)譜檢測都是一種挑戰(zhàn)。因此受到極微量樣本制備、超高靈敏度高分辨生物質(zhì)譜儀等限制，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析一直都是“圣杯”一樣存在。
PART03
目前為解決單細(xì)胞極微量樣本制備的難點(diǎn)，科學(xué)家們開發(fā)出來一種體系是基于TMT進(jìn)行標(biāo)記的方法，如scope2。
Scope2研究系統(tǒng)主要是通過TMT的多通道優(yōu)勢，將其中一個通道作為carrier cell通道，一般為20~200個細(xì)胞量的樣品，其他通道作為單細(xì)胞通道。各通道在完成TMT標(biāo)記后進(jìn)行混合上機(jī)檢測。
采用carrier cell通道的優(yōu)點(diǎn)有如下幾點(diǎn)，第一、可以有效補(bǔ)償單細(xì)胞樣品在后續(xù)分析中的損失；第二、其對蛋白質(zhì)的定性可以使用含量更高的carrier cell通道中的MS/MS，而借助TMT各通道報告離子進(jìn)行定量；第三、大大提高單細(xì)胞檢測的通量。
基于scope2技術(shù)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程
https://doi: 10.1186/s13059-021-02267-5
除此之外，還有研究者采用基于液滴的樣品前處理系統(tǒng)，如nanoPOTS、gOAD、nested nanoPOTS(N2) chip和proteoCHIP系統(tǒng)，這類系統(tǒng)主要優(yōu)點(diǎn)有：1）液滴體積小可以減少與管壁接觸轉(zhuǎn)移帶來的樣品損失問題；2）小體積液滴與單細(xì)胞樣品兼容性更好，具有更高的酶切反應(yīng)速率。但也有其不足之處，比如該液滴操作系統(tǒng)需要在具備相關(guān)操作能力的實(shí)驗(yàn)室開展，還需開發(fā)適用于液滴體系上樣的新技術(shù)。
基于液滴體系的樣品前處理和離心處理上樣系統(tǒng)proteoCHIP的工作流程
https://doi.org/10.1101/2021.02.17.431689
其中在N2 chip和proteoCHIP系統(tǒng)中結(jié)合了微流控液滴和TMT標(biāo)記的技術(shù)，可進(jìn)一步提高單細(xì)胞分析的檢測通量和定量蛋白質(zhì)數(shù)目。
此外，還有一類是結(jié)合超高靈敏度質(zhì)譜儀timsTOF和DIA采集模式，在前處理過程中縮小反應(yīng)體系到2ul左右以此減少樣品損失，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
基于液滴體系的樣品前處理和液滴自動進(jìn)樣器的N2系統(tǒng)工作流程
https://doi.org/10.1101/2021.04.14.439828
基于Evosep和timsTOF-DIA聯(lián)用的單細(xì)胞樣品前處理系統(tǒng)
https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933
PART04
通過單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析可以根據(jù)差異蛋白質(zhì)信息來區(qū)分不同腫瘤細(xì)胞的分子分型，相較于傳統(tǒng)的病理組織分析技術(shù)更加精細(xì)準(zhǔn)確，對于理解疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。
另外，一些生物學(xué)樣品由于稀少，單細(xì)胞技術(shù)是唯一可以對其進(jìn)行研究的技術(shù)。例如在胚胎發(fā)育早期階段少量個數(shù)的細(xì)胞、在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域越來越得到重視的單個神經(jīng)元以及數(shù)量稀少的循環(huán)腫瘤細(xì)胞等，傳統(tǒng)蛋白組學(xué)技術(shù)無法獲得這類樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，因此單細(xì)胞蛋白質(zhì)組將是必要的手段，對于組織亞結(jié)構(gòu)研究、胚胎發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性、CTC細(xì)胞、干細(xì)胞分化和神經(jīng)研究提供重要的生物學(xué)意義。