G418和嘌呤霉素在化學性質、作用機制及在生物學研究中的應用等方面存在顯著差異。
G418，是一種氨基糖苷類抗生素。它主要通過干擾核糖體的功能來阻斷細胞的蛋白質合成，從而對原核和真核細胞產生毒性，包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞等。在分子遺傳試驗中，G418是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。當neo基因被整合進真核細胞DNA后，能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA，從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達，使細胞獲得對G418的抗性能在含有G418的選擇性培養基中生長。
而嘌呤霉素則是一種氨基核苷類抗生素，是原核和真核生物中蛋白質翻譯的有效抑制劑。它的化學結構與tRNA分子末端類似，能夠同氨基酸結合，代替氨?；膖RNA同核糖體的A位點結合，并摻入到生長的肽鏈中。然而，嘌呤霉素雖然能同A位點結合，卻不能參與隨后的任何反應，這會導致蛋白質合成的終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。由于嘌呤霉素對原核和真核生物的翻譯過程均有干擾作用，因此它主要被用作研究蛋白質合成的生物化學工具。
因此：G418主要通過干擾核糖體功能來阻斷蛋白質合成，用于穩定轉染的抗性篩選；在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面應用。
而嘌呤霉素則通過模擬tRNA分子末端來抑制蛋白質翻譯過程，主要用于研究蛋白質合成的生物化學工具及篩選穩定轉染的細胞株。
G418和嘌呤霉素篩怎么篩選呢？
篩選步驟來啦！
一、G418篩選操作：
1.制備篩選培養基：確定G418的最佳篩選濃度需要考慮細胞類型、生長條件以及其他環境因素，并通過實驗來確定具體的濃度范圍，在細胞進行慢病毒感染前用不同濃度的G418培養細胞：
2.復蘇細胞：將細胞傳2-3代，待細胞生長穩定后，再傳代，計數，大約2000個/孔鋪板于24孔培養板中
3. 以哺乳動物細胞篩選為例：
1. 用培養基將G418溶液稀釋為0 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培養基（含有G418的完全培養基），每個濃度3-4個重復.
2. .12小時后換液，將培養孔中培養基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養基，隔天更換一次篩選培養基，培養10-14天，以最低細胞全部死亡濃度為基準。
確定G418濃度后開始感染細胞：
3. 將需要感染的細胞鋪6孔板（20萬/孔），第二天轉染，6小時后換新鮮正常培養基。轉染24小時后加最佳篩選濃度G418培養基，隔天換液。
4. 換液一兩次后（換液后培養過夜），細胞達50%-80%時，吸出所有培養液，離心3000-4000rpm，棄上清，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養液，0.22um過濾，混勻4℃備用。
5. 培養6天左右細胞大量死亡時，可以換用適應性培養基，即5中所配制。或者可以增加血清濃度培養，例如原來用10%血清，此時則可以采用20%血清。
6. .培養10天后將G418濃度減半，維持篩選壓力。
7. 篩選約14天后可見有抗性xx細胞出現，采用單克隆法或者刮除陰性克隆進行細胞的培養和擴增。
二、嘌呤霉素的篩選步驟：
2.1.預實驗確定細胞的最佳適應嘌呤霉素的濃度；
1) Day 1：將目的(要進行穩轉株改造的細胞）細胞種于12或24孔板中；首選鋪板11個孔；
2) Day2：第2天：靶細胞應該大約80-90%融合;在目標細胞的首選培養基中加入嘌呤霉素。嘌呤霉素的終濃度應為1-10μg/mL，分別為0ug/ml一孔到10ug/ml一孔，每孔的增量為1μg/mL，加入含有等濃度的嘌呤霉素培養基，并做好標記；
3) Day3+: 每隔一天換一次新鮮的含嘌呤霉素的培養基；在三到五天后導致完全細胞死亡的嘌呤霉素的最低濃度是實驗中應用于選擇的濃度，也可以用更精細的嘌呤霉素增量重復此滴定，以確定更精確的最佳嘌呤霉素濃度。
2.2細胞篩選
1）細胞鋪板，鋪兩個樣本，正常細胞株和感染好的細胞株各鋪一孔，置37度 5%CO2培養
2）待細胞生長到60%左右的密度，加步驟2.1得出的嘌呤霉素進行篩選；
3）每天換液48-72小時后未感染的正常細胞株全部死亡，感染的穩轉株正常生長，得出，穩轉株構建成功.
一鍵直達：
