養(yǎng)了細(xì)胞后就會(huì)發(fā)現(xiàn)，即使是一瓶細(xì)胞，但是每個(gè)細(xì)胞的分裂時(shí)間卻不一致，有些已經(jīng)分裂生長(zhǎng)完成了，有些細(xì)胞還在分裂初始，但是在大部分實(shí)驗(yàn)中，都需要細(xì)胞保持生長(zhǎng)周期同步化，才能讓實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更為精確。因此，只能進(jìn)行人工干預(yù)啦。
1.有絲分裂搖脫法（Mitotic Shake-off）
原理：M期細(xì)胞變圓、貼附力下降，通過(guò)輕輕搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶可使M期細(xì)胞脫落
操作流程：
1. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（密度5-8×10?/mL）
2. 加入諾考達(dá)唑 40-100 ng/mL
3. 培養(yǎng)10-14 h
4. 離心收集（300×g，5 min）
5. 冷PBS（4℃）洗滌2次
【關(guān)鍵步驟：低溫促進(jìn)微管解聚，增強(qiáng)M期阻滯】
6. 37℃溫培養(yǎng)基洗滌1次
7. 重懸于新鮮完全培養(yǎng)基，37℃孵育
8. 每隔15-30 min取樣，流式檢測(cè)pHH3（M期標(biāo)志）
9. 當(dāng)M期細(xì)胞>80%時(shí)，即為同步化M期細(xì)胞
2. G0期誘導(dǎo)（血清饑餓法）
原理：剝奪生長(zhǎng)因子使細(xì)胞退出周期進(jìn)入G0期
1、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；
2、用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，注：有時(shí)候完全去掉細(xì)胞發(fā)生死亡，因此可以嘗試用含1%-2%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24-48h；
3、用胰蛋白酶消化細(xì)胞即可收獲G0期細(xì)胞
3. 雙胸苷阻斷法（Thymidine Double Block） — 最常用
Day 0: 接種細(xì)胞（30-40%密度）
Day 1: 第1次胸苷阻斷（2 mM，16 h）
↓ PBS洗3次，換新鮮培養(yǎng)基
Day 2: 釋放培養(yǎng)（9 h）
↓
第2次胸苷阻斷（2 mM，16 h）
↓ PBS洗3次
Day 3: 獲得同步化細(xì)胞（此時(shí)為G1/S邊界）
可每隔2 h取樣追蹤周期進(jìn)程
懸浮細(xì)胞需重點(diǎn)關(guān)注以下哦:
一、細(xì)胞洗滌：
1. 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管
2. 室溫或37℃，300×g，5 min離心
3. 棄上清，輕彈管底分散細(xì)胞團(tuán)
4. 加入37℃預(yù)溫培養(yǎng)基/PBS，輕柔吹打重懸
5. 重復(fù)2-3次
二、防成團(tuán)技巧：
- 使用硅化離心管
- 加入0.1-0.5 mM EDTA（不影響大多數(shù)細(xì)胞）
- 使用寬口吸頭，減少機(jī)械剪切