基于二代測(cè)序平臺(tái)(NGS)的scATAC-seq技術(shù)利用Tn5酶的DNA隨機(jī)打斷功能，可以富集染色質(zhì)局部開放區(qū)域上的基因組DNA短片段（通常80-300 bp），這些短片段被當(dāng)作開放染色質(zhì)（open chromatin）的信號(hào)。然而，在使用過量的Tn5轉(zhuǎn)座酶切割并標(biāo)記染色質(zhì)局部開放區(qū)域的過程中也會(huì)產(chǎn)生一些長(zhǎng)片段基因組DNA，這些長(zhǎng)片段DNA是否包含染色質(zhì)狀態(tài)信息尚不清楚。
2022年10月11日，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組在Cell Research 發(fā)表了題為“scNanoATAC-seq: a long-read single-cell ATAC sequencing method to detect chromatin accessibility and genetic variants simultaneously within an individual cell”的論文，首次報(bào)道了名為scNanoATAC-seq的基于三代測(cè)序平臺(tái)（單分子測(cè)序平臺(tái)）的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)整合了長(zhǎng)讀段單分子測(cè)序平臺(tái)和單細(xì)胞染色質(zhì)可及性測(cè)序技術(shù)（scATAC-seq：Single cell Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)染色質(zhì)開放狀態(tài)以及基因組結(jié)構(gòu)變異。
該研究中使用的NGS DNA建庫(kù)試劑盒（目錄號(hào)：N233）來(lái)自近岸蛋白，近岸蛋白的NovoNGS? DNA Library FlashPrep Kit for Illumina?已助力多篇高分文章發(fā)表，是您二代測(cè)序建庫(kù)的得力助手！
該研究開發(fā)了基于單分子測(cè)序平臺(tái)的單細(xì)胞ATAC-seq測(cè)序技術(shù)（如圖1所示），并且探索了其在生物學(xué)問題上的應(yīng)用。首先該研究利用五種人類細(xì)胞系（GM12878, eHAP1, HEK293T, HFF-1 and K562）以及在體的人類外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，證實(shí)了scNanoATAC-seq技術(shù)可以像基于二代測(cè)序平臺(tái)的scATAC-seq一樣根據(jù)染色質(zhì)開放狀態(tài)對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行準(zhǔn)確分群并且揭示關(guān)鍵的染色質(zhì)開放狀態(tài)調(diào)控信息（如圖2所示）。
圖1. scNanoATAC-seq實(shí)驗(yàn)流程圖（左）和分析原理圖（右）
接下來(lái)利用scNanoATAC-seq技術(shù)長(zhǎng)讀段的優(yōu)勢(shì)對(duì)等位基因特異性的染色質(zhì)開放區(qū)域進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定。對(duì)于二倍體細(xì)胞，基于二代測(cè)序平臺(tái)的ATAC-seq技術(shù)要區(qū)分一個(gè)染色質(zhì)開放區(qū)域的兩個(gè)等位基因，需要在該開放區(qū)域（通常長(zhǎng)度在80-300bp之間）內(nèi)有雜合的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。而基于三代測(cè)序平臺(tái)的scNanoATAC-seq技術(shù)要區(qū)分一個(gè)染色質(zhì)開放區(qū)域的兩個(gè)等位基因，不需要該開放區(qū)域內(nèi)有雜合SNP位點(diǎn)，而只需要在該開放區(qū)域兩側(cè)的各4000bp內(nèi)有雜合SNP位點(diǎn)或者是雜合結(jié)構(gòu)變異即可。
圖2. scNanoATAC-seq對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行分群的效果
相比于基于二代測(cè)序平臺(tái)的ATAC-seq技術(shù)，基于三代測(cè)序平臺(tái)的scNanoATAC-seq技術(shù)可以在同一個(gè)細(xì)胞系中檢測(cè)到十倍以上的等位基因特異性的染色質(zhì)開放區(qū)域。例如，應(yīng)用scNanoATAC-seq技術(shù)，該研究在人類B淋巴細(xì)胞系GM12878的印記基因TRIM61的啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域檢測(cè)到了等位基因特異性的染色質(zhì)開放區(qū)域（如圖3所示，母源等位基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)處于開放狀態(tài)，父源等位基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)處于關(guān)閉狀態(tài)），而此染色質(zhì)開放區(qū)域內(nèi)在GM12878細(xì)胞系中不存在雜合SNP位點(diǎn)，不能被短讀段的ATAC-seq方法測(cè)到。
圖3. 用scNanoATAC-seq技術(shù)鑒定出來(lái)的印記基因TRIM61的啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域的等位基因特異性的染色質(zhì)開放區(qū)域
值得討論的是，在染色質(zhì)開放程度較高的基因組DNA裸露區(qū)域，Tn5轉(zhuǎn)座酶的濃度越高，得到的DNA文庫(kù)片段越短。由此可以推斷，在使用過量Tn5轉(zhuǎn)座酶的情況下，scNanoATAC-seq技術(shù)捕獲到的長(zhǎng)讀段的染色質(zhì)開放區(qū)域中，除了通常的染色質(zhì)開放區(qū)域（open chromatin）外，還可能存在開放程度較弱的染色質(zhì)區(qū)域，例如寬容染色質(zhì)區(qū)域（permissive chromatin），而這些是短讀段測(cè)序無(wú)法檢測(cè)到的。事實(shí)上，相較于基于二代測(cè)序平臺(tái)的scATAC-seq技術(shù), 基于三代測(cè)序平臺(tái)的scNanoATC-seq技術(shù)檢測(cè)到了更多的核小體占位信息（如圖4所示）。另外，關(guān)于比對(duì)困難的基因組區(qū)域例如重復(fù)序列區(qū)域的染色質(zhì)開放狀態(tài)的研究，相較于二代測(cè)序平臺(tái)的scATAC-seq，基于三代測(cè)序平臺(tái)的scNanoATAC-seq也存在明顯優(yōu)勢(shì)。
圖4. scNanoATAC-seq和10x scATAC-seq測(cè)序片段在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近信號(hào)富集的情況
然后，研究利用scNanoATAC-seq技術(shù)可以在一個(gè)單細(xì)胞中檢測(cè)染色質(zhì)開放狀態(tài)的同時(shí)，還可以檢測(cè)基因組中的各種結(jié)構(gòu)變異事件（插入，缺失，重復(fù)，倒位，易位等）。以人類慢性髓系白血病（CML）細(xì)胞系K562的大量細(xì)胞基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)，該研究發(fā)現(xiàn)scNanoATAC-seq技術(shù)在K562細(xì)胞系（至少5個(gè)單細(xì)胞支持）中分別檢測(cè)到了7688個(gè)插入事件（占基準(zhǔn)的64.6%）和6120個(gè)缺失事件（占基準(zhǔn)的67.7%），準(zhǔn)確度分別為93.8% 和75.5%。除了經(jīng)典的BCR-ABL1易位事件，該研究也可以檢測(cè)到長(zhǎng)達(dá)89 kb的缺失事件，該缺失事件同時(shí)截?cái)嗔薢RANB1和CTBP2兩個(gè)基因（如圖5所示）。而已知CTBP2可以抑制白血病細(xì)胞增殖，這意味著scNanoATAC-seq技術(shù)檢測(cè)到了K562細(xì)胞系中潛在的導(dǎo)致抑癌功能缺失的結(jié)構(gòu)變異事件。
隨后使用scNanoATAC-seq數(shù)據(jù)分析了單個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)變化(CNVs)。eHAP1是一個(gè)完全的單倍體細(xì)胞系，在eHAP1中沒有觀察到大規(guī)模的CNVs。GM12878和HFF-1被認(rèn)為是沒有明顯CNVs的二倍體細(xì)胞系，而該研究在GM12878細(xì)胞系中檢測(cè)到1號(hào)和16號(hào)染色體上有大規(guī)模CNVs的亞克隆。由于HFF-1是雄性的衍生細(xì)胞系，該研究觀察到其X染色體的拷貝數(shù)是常染色體的一半，和推測(cè)結(jié)果一致。該研究還在K562的7、9、X染色體和HEK293T的13染色體上發(fā)現(xiàn)了大規(guī)模的CNVs，這與之前的研究結(jié)果一致。綜上所述，scNanoATAC-seq技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的基因組拷貝數(shù)變異，能準(zhǔn)確地區(qū)分出整倍體細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞，因此可以應(yīng)用于癌癥的研究。
圖5. 用scNanoATAC-seq技術(shù)鑒定出來(lái)的ZRANB1和CTBP2兩個(gè)基因上的結(jié)構(gòu)變異（大片段缺失）事件（上）以及PCR驗(yàn)證結(jié)果（下）
最后，利用scNanoATAC-seq技術(shù)的長(zhǎng)讀段優(yōu)勢(shì)在GM12878細(xì)胞系中檢測(cè)到了3868對(duì)染色質(zhì)共開放事件。以SOX4基因上找的共開放事件為例，這些相鄰的共同開放的基因組功能元件由直接連接兩個(gè)開放區(qū)域的長(zhǎng)讀段支持，其讀段長(zhǎng)度分布與非共開放區(qū)域的讀段長(zhǎng)度分布明顯不同（如圖6和圖7所示）。另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明6號(hào)染色體組蛋白基因簇上的幾個(gè)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子也是共開放的。
圖6. 利用scNanoATAC-seq鑒定相鄰的調(diào)控元件共開放事件的原理
而利用基于二代測(cè)序平臺(tái)的scATAC-seq技術(shù)分析染色質(zhì)共開放事件高度依賴每個(gè)單細(xì)胞的檢測(cè)覆蓋度，如果scATAC-seq的檢測(cè)覆蓋度比較低，就很難檢測(cè)到染色質(zhì)共開放事件。更重要的是，即使在scATAC-seq的檢測(cè)覆蓋度很高的情況下，其中一半的染色質(zhì)共開放事件的信號(hào)是來(lái)自一個(gè)單細(xì)胞中兩個(gè)不同等位基因的共同開放，是技術(shù)假象，而基于三代測(cè)序平臺(tái)的scNanoATAC-seq技術(shù)檢測(cè)到的染色質(zhì)共開放事件的信號(hào)都是來(lái)自單個(gè)DNA分子的直接連鎖信息，都是真實(shí)的來(lái)自一個(gè)單細(xì)胞中同一個(gè)等位基因的共同開放事件，沒有上述這類技術(shù)假象。
圖7. 發(fā)生在SOX4基因附近的調(diào)控元件共開放事件
綜上，scNanoATAC-seq技術(shù)擁有廣泛的生物學(xué)應(yīng)用前景。該方法可以在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)染色質(zhì)可及性和基因組結(jié)構(gòu)變異。該方法利用長(zhǎng)讀段優(yōu)勢(shì)可以在單個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部沒有雜合SNP位點(diǎn)標(biāo)記的等位基因特異性的染色質(zhì)開放區(qū)域，這是短讀段的scATAC-seq技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。該方法還可以發(fā)現(xiàn)具有直接證據(jù)支持的，發(fā)生在同一個(gè)等位基因不同調(diào)控元件上的共開放事件。scNanoATAC-seq技術(shù)的出現(xiàn)預(yù)示著單細(xì)胞表觀基因組三代測(cè)序時(shí)代的到來(lái)。
近岸蛋白提供ATAC實(shí)驗(yàn)方案（目錄號(hào)：N248），采用新型Tn5轉(zhuǎn)座酶技術(shù)，將裸露的雙鏈DN**段化的同時(shí)引入測(cè)序接頭，再經(jīng)過后續(xù)提取與PCR擴(kuò)增，得到直接用于Illumina測(cè)序平臺(tái)的二代測(cè)序文庫(kù)，操作便捷，數(shù)據(jù)重復(fù)性好。
近岸蛋白相關(guān)產(chǎn)品
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目錄號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
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NovoNGS? DNA Library FlashPrep Kit for Illumina? |
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Chromatin Profile Kit for Illumina |
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NovoNGS? DNA Clean Beads |
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Tagment DNA Extract Beads |
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NovoNGS? CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity Kit (for Illumina?) |
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NovoNGS? ChiTag? pAG-Transposase |
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NovoNGS? ChiTag? pAG-Transposome |
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NovoNGS? Tn5 Transposase |