血管生成不僅涉及包括癌癥生物學(xué)和非腫瘤疾病在內(nèi)的病理條件，還涉及包括生殖、發(fā)育和修復(fù)在內(nèi)的許多生物學(xué)過程。在血管生成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞（EC）在血管生成因子與其受體結(jié)合、釋放蛋白酶以溶解基底膜、向血管生成信號遷移、增殖和細(xì)胞數(shù)量增加以形成新血管后發(fā)生激活。最后，內(nèi)皮細(xì)胞的重組形成了三維血管系統(tǒng)。HUVEC管形成測定法是一種簡單但公認(rèn)的體外血管生成測定法，基于內(nèi)皮細(xì)胞在生長因子減少的基底膜提取物凝膠上培養(yǎng)時形成三維毛細(xì)管狀管狀結(jié)構(gòu)的能力。在測定過程中，內(nèi)皮細(xì)胞分化、定向遷移以排列、分支并形成血管的管狀多邊形網(wǎng)絡(luò)。
需要準(zhǔn)備的試劑：
Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）（高糖L-谷氨酰胺，500毫升）
原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）（啟達(dá)生物, 貨號：CD0290）
ECGM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基/套裝（啟達(dá)生物, 貨號：P1001）
條件培養(yǎng)基（CM）
備注：靶細(xì)胞系也可以是那些有或沒有藥物治療或表達(dá)感興趣基因的細(xì)胞系。
需要準(zhǔn)備的耗材：
細(xì)胞培養(yǎng)箱
帶數(shù)碼相機(jī)的倒置顯微鏡（尼康TMS）
Scion Image軟件
96孔板
離心機(jī)
細(xì)胞計數(shù)器
T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
HUVEC成管操作protocol：
A. 從靶細(xì)胞系制備條件培養(yǎng)基
1. 為了制備條件培養(yǎng)基（CM），接種靶細(xì)胞并生長至30-40%匯合（取決于細(xì)胞系的生長速率），用無血清DMEM（例如，對于T75組織培養(yǎng)瓶為10ml；抗生素的存在與否無關(guān)緊要）2. 代替生長培養(yǎng)基24小時，然后當(dāng)細(xì)胞在T75組織培養(yǎng)瓶中達(dá)到60-80%匯合時收獲CM。
如果收集CM后未立即使用，則取0.5 ml CM等分試樣，并在-80°C下儲存。
B.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞的制備
1. 按照培養(yǎng)基配比要求配好ECGM完全培養(yǎng)基。
2. 根據(jù)需要將HUVEC細(xì)胞接種在T25或T75培養(yǎng)瓶中，使其達(dá)到70-80%的融合。
3. 在不含抗生素的培養(yǎng)基200PRF中進(jìn)行試管形成測定之前，去除血清使HUVEC細(xì)胞饑餓3-6小時（例如，對于T25組織培養(yǎng)瓶為5毫升）。
注：在血清饑餓結(jié)束時，轉(zhuǎn)至程序C步驟1。
4. 在用生長因子減少的基質(zhì)膠涂布96孔板后，用胰蛋白酶從燒瓶表面去除細(xì)胞，用DMEM與血清中和，在室溫下以1200rpm（276xg）離心3分鐘使細(xì)胞沉淀，重懸于2-3ml無血清DMEM中，通過計數(shù)細(xì)胞來測定HUVEC的濃度，并通過向上和向下吸移幾次以4×105/ml無血清DMEM重懸HUVEC細(xì)胞，以確保均勻的單細(xì)胞懸浮液。
注：對于生長因子減少的基質(zhì)膠，應(yīng)盡可能減少解凍/冷凍周期。
5. 在將500μl HUVEC細(xì)胞懸浮液移液到1.5 ml試管中的同時充分混合。使用臺式離心機(jī)以4000rpm（1100rcf）的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞降速3分鐘。在不干擾細(xì)胞沉淀的情況下小心地吸出上清液。盡可能多地去除上清液。根據(jù)要使用的靶細(xì)胞系的數(shù)量，在1.5ml試管中制備適當(dāng)數(shù)量的HUVEC細(xì)胞。
注：每個靶細(xì)胞系CM將懸浮一管HUVEC，每個懸浮的HUVEC將分配3個一式三份的孔。因此，每個靶細(xì)胞系總共將使用3個孔。
6. 解凍從程序a步驟2收集的0.5ml等分的目標(biāo)細(xì)胞系CM，并用胎牛血清將其補(bǔ)充至1%的最終濃度，以在程序B步驟5中重懸HUVEC細(xì)胞顆粒。
注：每個靶細(xì)胞系應(yīng)一式三份（每個孔需要100μl HUVEC細(xì)胞懸浮液）。
C . 用生長因子減少的基質(zhì)膠（啟達(dá)生物，貨號SD0054）涂覆96孔板
1. 使用前一天在4°C下解凍適當(dāng)體積的基質(zhì)膠。
2. 將96孔板和移液管尖端在-20°C下預(yù)冷2-3小時。
3. 在HUVEC細(xì)胞血清饑餓接近尾聲時，在計數(shù)HUVEC之前，在冰上預(yù)冷96孔板的每孔中，等分試樣50μl的基質(zhì)膠。旋轉(zhuǎn)鋪板，直到凝膠均勻地分布在整個孔上。避免氣泡的形成是非常重要的。使其在室溫下在水平表面上聚合1小時。
D. 將HUVEC細(xì)胞分配到涂布的96孔板上
1. 將100μl程序B步驟6中獲得的HUVEC細(xì)胞懸浮液完全混合到96孔板的標(biāo)記孔中。將平板在37°C、5%CO2下培養(yǎng)4-6小時。
2. 用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞。拍攝毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的圖像，并使用Scion Image軟件計算管道長度。
與CM孵育6小時（100x，100μm）后，HUVEC在基質(zhì)凝膠上成管。
參考文獻(xiàn)：
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