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背景
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外泌體（Exosome）是由活細(xì)胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)；存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清、血漿、唾液、尿液、羊水以及其它生物體液中；外泌體攜帶有多種蛋白質(zhì)、脂類、RNA等重要信息，不僅在細(xì)胞與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起重要作用，更有望成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物。

圖1：外泌體的分泌以及外泌體的組成

外泌體研究路線
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翌圣外泌體分離試劑
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只需簡單4步，輕松獲取外泌體

圖2：翌圣外泌體提取試劑盒分離過程

三大質(zhì)檢驗(yàn)證，符合鑒定“金標(biāo)準(zhǔn)”???????

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圖3：翌圣外泌體試劑盒提取外泌體質(zhì)檢方法

翌圣外泌體鑒定試劑盒
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翌圣生物針對(duì)外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101檢測(cè)而研發(fā)的一款高效且方便實(shí)用的外泌體鑒定試劑盒產(chǎn)品適用于人、大鼠、小鼠外泌體的鑒定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

注：P為CD63&TSG101陽性對(duì)照品，S為外泌體樣品

外泌體應(yīng)用
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1、外泌體在肝癌發(fā)展、診斷和治療中的作用

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院李偉華等人在Molecular Cancer雜志發(fā)表的有關(guān)外泌體研究的綜述：分別介紹了1、外泌體在慢性乙型肝炎至肝細(xì)胞癌過程中的作用 2、外泌體與肝細(xì)胞癌的關(guān)系 3、外泌體在肝癌診斷和預(yù)后中的應(yīng)用 4、外泌體在肝癌治療中的應(yīng)用，對(duì)相關(guān)涉及的最新研究內(nèi)容進(jìn)行總結(jié)以揭示外泌體在肝癌的發(fā)生，發(fā)展，診斷和治療中的重要性，為研究人員進(jìn)一步闡明外泌體在肝癌中的作用機(jī)制，并促進(jìn)外泌體在臨床診斷中的應(yīng)用和肝癌的治療提供參考。

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圖4：外泌體在CHB轉(zhuǎn)化為HCC過程中的作用機(jī)制

引自：Li X, Li C, Zhang L, Wu M, Cao K, Jiang F, Chen D, Li N, Li W. The significance of exosomes in the development and treatment of hepatocellular carcinoma. MolCancer. 2020 Jan 4;19(1):1.

2、外泌體介導(dǎo)的miR-567在乳腺癌曲妥珠單抗中的關(guān)鍵作用

2020年1月22日，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院韓明利等人在Cell death&disease雜志發(fā)表的文章提供來自乳腺癌和生物信息學(xué)分析的可公開獲得的表達(dá)譜數(shù)據(jù)被用于篩選曲妥珠單抗耐藥的潛在miRNA進(jìn)行增益或缺失功能測(cè)定。結(jié)果表明，與應(yīng)答患者相比，曲妥珠單抗耐藥患者的miR-567顯著降低；與親代細(xì)胞相比，曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中的miR-567也下調(diào)。miR-567的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了化學(xué)耐藥性，而miR-567的沉默在體外和體內(nèi)均可誘導(dǎo)曲妥珠單抗。揭示了miR-567在抑制自噬和增加對(duì)曲妥珠單抗的化學(xué)敏感性中的基本作用，表明它可能是乳腺癌患者的有希望的治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)。

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圖5：外泌體介導(dǎo)的miR-567轉(zhuǎn)移曲妥珠單抗可逆轉(zhuǎn)耐藥性

引自：Han M, Hu J, Lu P, et al. Exosome-transmitted miR-567 reverses trastuzumab resistance by inhibiting ATG5 in breast cancer.?Cell Death Dis. 2020;11(1):43. Published 2020 Jan 22.

外泌體標(biāo)記檢測(cè)
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一、親脂性染料?:PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以穩(wěn)定的與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光，主要用于細(xì)胞體外標(biāo)記、體外細(xì)胞增殖研究以及體內(nèi)外的細(xì)胞失蹤研究。

圖6：PKH67標(biāo)記外泌體被巨噬細(xì)胞吸收

引自：Wang Z, Maruyama K, Sakisaka Y, et al. Cyclic Stretch Force Induces Periodontal Ligament Cells to Secrete Exosomes That Suppress IL-1β Production Through the Inhibition of the NF-κB Signaling Pathway in Macrophages.?Front Immunol. 2019;10:1310. Published 2019 Jun 20.

二、親脂性羰花青染料（carbocyanine dyes）:DiI/DiD/DiO/DiR

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列親脂性的熒光染料，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。

圖7：DiD標(biāo)記的外泌體與PC12細(xì)胞孵育3H后共聚焦觀察的結(jié)果

引自：Tian T, Zhu YL, Zhou YY, Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem. 2014 Aug 8;289(32):22258-67

圖8：結(jié)果所示體內(nèi)靜脈注射DiR標(biāo)記的外泌體，24H后進(jìn)行成像效果

引自：Wiklander OP, Nordin JZ, O'Loughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.

三、滲透型的化合物標(biāo)記法：CFSE/CFDA/Calcein-AM

1、CFSE：羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯，常稱為 CFSE，可被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。 這種試劑沒有顏色和熒光，直至細(xì)胞內(nèi)的酯酶去除其醋酸鹽基團(tuán)，產(chǎn)生能發(fā)出明亮熒光的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯。 琥珀酰亞胺酯與細(xì)胞內(nèi)氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定且能用醛固定劑固定的熒光偶聯(lián)物。

圖9：SKOV3細(xì)胞對(duì)SKOV3外泌體的攝取過程

引自：Escrevente, Cristina et al. “Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.”?BMC cancer?vol. 11 108. 27 Mar. 2011,

2、Calcein-AM：Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出熒光被檢測(cè)到。

圖10：在無血小板血漿中，用Calcein-AM，鈣黃綠素紫，di-8-ANEPPS，乳黏附素和CD61-APC染色流式分析圖

引自：de Rond L, Libregts SFWM, Rikkert LG, et al. Refractive index to evaluate staining specificity of extracellular vesicles by flow cytometry.?J Extracell Vesicles. 2019;8(1):1643671. Published 2019 Jul 25.
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