腦中可溶性淀粉樣β肽（AβOs）的積聚已被認(rèn)為與阿爾茨海默病中的突觸衰竭和記憶損害有關(guān)。在這項研究中，研究者使用NUsc1進行治療，這是一種選擇性靶向AβOs的單鏈變量片段抗體（scFv），能夠預(yù)防小鼠海馬切片中長時程增強的抑制和AβOs引起的記憶損害。
里約熱內(nèi)盧州聯(lián)邦大學(xué)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)研究所的研究者們，開發(fā)了一種腺相關(guān)病毒載體AAV-NUsc1，用于在大腦內(nèi)驅(qū)動NUsc1的神經(jīng)元表達。AAV-NUsc1在成年人腦切片中誘導(dǎo)NUsc1的表達和分泌，并且抑制了AβOs與神經(jīng)元的結(jié)合，以及AβOs誘導(dǎo)的大鼠海馬原代培養(yǎng)中樹突棘喪失。用AAV-NUsc1治療小鼠阻止了AβOs引起的記憶損害，并且更重要的是逆轉(zhuǎn)了APPswe/PS1ΔE9老年阿爾茨海默病模型小鼠的記憶缺陷。研究成果以“AAV-mediated neuronal expression of a scFv antibody selective for Aβ oligomers protects synapses and rescues memory in Alzheimer models”為題，發(fā)表在Moleculat Therapy（IF：12.91）上。
研究結(jié)果
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1.NUsc1能夠預(yù)防AβOs引起的海馬長時程增強和記憶方面的損害。
首先，研究者們測試了外源性重組NUsc1是否可以阻斷AβOs引起的海馬長時程增強（LTP）的抑制和記憶損失。將小鼠海馬切片暴露于200nM的AβOs，并測量Schaeffer collaterals高頻刺激引起的LTP反應(yīng)。與之前的研究一致，暴露于AβOs的海馬切片LTP受到抑制。相反，在應(yīng)用AβOs之前用NUsc1處理的切片表現(xiàn)出正常的LTP。對照測量顯示NUsc1對控制組海馬切片的LTP沒有影響（即在沒有AβOs的情況下）。為了確定NUsc1是否可以預(yù)防AβOs引起的記憶損害，在小鼠的腦室內(nèi)注射（i.c.v.）注入NUsc1，然后在注射AβOs前30分鐘進行i.c.v.給藥，使用新物體識別（NOR）測試評估它們的記憶。與先前的研究一致，注射AβOs的小鼠在注射AβOs后的24小時和7天都表現(xiàn)出記憶損害。相反，NUsc1處理的小鼠在注射AβOs后的24小時和7天都表現(xiàn)出正常的NOR測試結(jié)果。
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2. AAV-NUsc1的構(gòu)建
接下來，研究者試圖確定AAV介導(dǎo)的NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)元表達是否對AD模型具有保護作用。構(gòu)建了一個AAV9載體，其中攜帶NUsc1的核苷酸序列（經(jīng)過單個氨基酸替換以在真核生物中表達），位于信號肽（SP）的下游，用于分泌途徑的導(dǎo)出，并由選擇性神經(jīng)元表達的synapsin I啟動子控制。通過選擇性靶向神經(jīng)元并使用3x109個AAV-NUsc1的單劑量，旨在防止NUsc1在大腦中過度表達，從而大程度地減少可能導(dǎo)致抗體自聚集的濃度依賴性和異常免疫或炎癥反應(yīng)的潛力。
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3. AAV-NUsc1在人類成人皮質(zhì)切片中誘導(dǎo)表達NUsc1的神經(jīng)元
為了檢驗AAV-NUsc1在AD中的轉(zhuǎn)化潛力，研究者們首先測試了AAV-NUsc1在成年人腦組織中驅(qū)動scFv抗體產(chǎn)生和分泌的能力。通過使用AAV9-mCherry對照載體進行初步測試，確認(rèn)了成年人皮層切片培養(yǎng)中的蛋白表達。將成年人皮層切片暴露于不斷增加的AAV-NUsc1滴度中，顯示出NUsc1的劑量依賴性表達。通過點狀免疫印跡分析確認(rèn)了NUsc1蛋白的表達和分泌到培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，AAV-NUsc1能轉(zhuǎn)導(dǎo)成年人神經(jīng)元并驅(qū)動NUsc1的表達和分泌。
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4. AAV-NUsc1減少AβOs與神經(jīng)元的結(jié)合，并預(yù)防AβOs引起的樹突棘喪失
為了確定AAV-NUsc1是否能保護神經(jīng)元免受AβOs的毒性影響，研究者們首先對成熟的海馬體外培養(yǎng)14天，并進行AAV-NUsc1的轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于已有報道顯示重組NUsc1可以阻止AβOs與神經(jīng)元的結(jié)合，研究者們想知道由AAV-NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元產(chǎn)生和分泌的NUsc1是否也能類似地阻止AβOs與神經(jīng)元的結(jié)合。試驗結(jié)果顯示，AAV-NUsc1的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元樹突中AβOs結(jié)合減少了約50%。
接著研究者們進一步研究了AβOs結(jié)合減少是否可以保護神經(jīng)元免受AβOs引起的樹突棘喪失。暴露于AβOs的神經(jīng)元顯示出較對照組文化減少的樹突棘密度，而在暴露于AβOs之前通過AAV-NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元表現(xiàn)出正常的樹突棘密度。
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5. AAV-NUsc1在小鼠AD模型中恢復(fù)了記憶。
作為在評估AAV-NUsc1在體內(nèi)起效之前的對照實驗，研究者們檢查了在小鼠中i.c.v.注射AAV9-mCherry對照載體后mCherry轉(zhuǎn)基因的大腦分布和神經(jīng)元表達情況。結(jié)果顯示，AAV-mCherry誘導(dǎo)了mCherry在整個小鼠大腦的表達，8周后在海馬和紋狀體表達明顯。
在確認(rèn)了i.c.v.注射的AAV9載體成功轉(zhuǎn)導(dǎo)AD相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元后，接下來在小鼠中i.c.v.注射了AAV-NUsc1，并通過qPCR和免疫印跡驗證了NUsc1在他們的大腦中的表達情況。
在i.c.v.注射AAV-NUsc1或用作對照的AAV-mCherry（對照組）2個月后，動物接受了i.c.v.注射AβOs。在進行新物體識別（NOR）記憶測試時，注射AβOs的小鼠和注射AAV-mCherry后注射AβOs的小鼠均未能完成任務(wù)。相比之下，接受AAV-NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)并注射AβOs的小鼠在NOR任務(wù)中表現(xiàn)正常。對照實驗顯示，AAV-NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)對對照組注射車載體的小鼠在NOR測試中沒有影響。
最后，測試了AAV-NUsc1對老年APPswe/PS1ΔE9 AD模型小鼠的記憶損害的有益作用。在i.c.v.注射AAV-NUsc1后兩個月，對APPswe/PS1ΔE9小鼠（或野生型同胞）進行記憶測試。通過ELISA評估了WT和APP/PS1小鼠的NUsc1腦內(nèi)水平。APPswe/PS1ΔE9小鼠在NOR測試和三箱社會交互實驗的社交記憶階段中都未能完成任務(wù)，但在三室測試的社交性階段中表現(xiàn)正常。結(jié)果顯示，接受AAV-NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)的APPswe/PS1ΔE9小鼠在NOR和社交記憶任務(wù)中表現(xiàn)正常，表明記憶損害得到逆轉(zhuǎn)。
研究總結(jié)
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這篇文章主要介紹了一種治療阿爾茨海默病的潛在方法，使用AAV介導(dǎo)的神經(jīng)元表達一種選擇性靶向Aβ寡聚體的scFv抗體，該方法可以保護突觸并在阿爾茨海默病模型中恢復(fù)記憶。研究人員使用NUsc1作為scFv抗體，并通過AAV9載體在大腦內(nèi)實現(xiàn)了NUsc1的神經(jīng)元表達。他們在實驗中觀察到，AAV-NUsc1轉(zhuǎn)導(dǎo)能降低AβOs與神經(jīng)元的結(jié)合，保護神經(jīng)元免受AβOs的毒性影響，并預(yù)防AβOs引起的樹突棘喪失。在小鼠模型中，通過AAV-NUsc1治療可預(yù)防AβOs引起的記憶損害，并且能逆轉(zhuǎn)老年阿爾茨海默病模型小鼠的記憶缺陷。這些結(jié)果表明，AAV介導(dǎo)的scFv抗體在治療阿爾茨海默病中具有潛在療效，并為基因介導(dǎo)免疫治療提供了一個有希望的治療策略
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