2023年1月，美國(guó)科學(xué)家通過(guò)對(duì)不同年齡和性別的小鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)和蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，通過(guò)分析鎖定了一個(gè)蛋白α-Klotho，該蛋白在調(diào)控膝關(guān)節(jié)軟骨退化中發(fā)揮重要作用，并深入挖掘了相關(guān)機(jī)制。研究成果以“Age-related matrix stiffening epigenetically regulates α-Klotho expression and compromises chondrocyte integrity”為題，發(fā)表在Nature Communications（IF：17.694 ）上。
研究結(jié)果
1. 衰老引起的軟骨退化
作者設(shè)置了3個(gè)年齡段的雌性和雄性小鼠組別，分別是年輕組（4-6個(gè)月齡）、中年組（10-14月齡）和老年組（18-24月齡），分別對(duì)應(yīng)人的20-30歲、38-47歲以及56-69歲，并對(duì)這6個(gè)組別的小鼠脛骨內(nèi)側(cè)軟骨完整性進(jìn)行了檢測(cè)（脛骨內(nèi)側(cè)軟骨是最受膝關(guān)節(jié)炎影響的區(qū)域）。檢測(cè)結(jié)果顯示，軟骨退化從中年開(kāi)始，這與人類臨床相關(guān)報(bào)道一致。軟骨表面的粗糙程度也隨著年齡增大而增加。有趣的是，軟骨退化程度和表面粗糙程度在雄性小鼠上比雌性小鼠更明顯。
2. 蛋白質(zhì)組學(xué)揭示與年齡和性別依賴的軟骨退化相關(guān)的信號(hào)通路
隨后，作者對(duì)不同性別的各3個(gè)年齡段小鼠的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)（共6個(gè)組別，每個(gè)組別5個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測(cè)到了6694個(gè)蛋白。與組織學(xué)觀察的結(jié)果相似，和雌性小鼠相比，雄性小鼠隨著時(shí)間的推移在單個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上呈現(xiàn)出更多的變化。不同性別的年老與年輕組間差異蛋白的KEGG富集分析顯示，在雌性小鼠中，有兩種通路顯著富集，而在雄性小鼠中，有八種通路顯著富集。在這些通路中，只有PI3K/Akt信號(hào)通路是隨著時(shí)間在中年就發(fā)生改變的?？傮w來(lái)說(shuō)，作者的結(jié)果和此前人關(guān)節(jié)炎的研究報(bào)道類似，PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)生擾動(dòng)。GO富集分析結(jié)果顯示，隨著年齡增長(zhǎng)上調(diào)的蛋白富集在代謝應(yīng)激、機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)（mechanotransduction）和凋亡，而下調(diào)蛋白富集在基質(zhì)組織、細(xì)胞增殖和蛋白代謝。
3. α-Klotho敲低驅(qū)動(dòng)雄性小鼠的軟骨退化
緊接著，作者挖掘潛在的調(diào)控蛋白。IPA分析（Ingenuity pathway analysis）發(fā)現(xiàn)激活的INS/INSR信號(hào)可能是個(gè)重要的調(diào)控因子。INS/INSR信號(hào)是PI3K/Akt信號(hào)的上游信號(hào)。因此，作者尋找可以抑制INS/INSR/PI3K軸的調(diào)控因子。其中一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子就是長(zhǎng)壽蛋白α-Klotho。作者分析了一個(gè)公開(kāi)的基因芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在原代軟骨細(xì)胞中抑制α-Klotho能顯著激活PI3K/Akt信號(hào)。同時(shí)，α-Klotho過(guò)表達(dá)已被發(fā)現(xiàn)在PTOA（創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎）模型中延緩軟骨退化，但α-Klotho是否在衰老相關(guān)的KOA（膝關(guān)節(jié)炎）模型中發(fā)揮作用并未被充分研究。因此，作者鎖定α-Klotho進(jìn)行后續(xù)研究。
作者檢測(cè)了小鼠和人軟骨中α-Klotho的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)α-Klotho的表達(dá)量均隨著年齡增長(zhǎng)而降低，且與男性中更嚴(yán)重的軟骨退化相關(guān)。
為了直接評(píng)估α-Klotho對(duì)軟骨健康的影響，作者檢測(cè)了Klotho雜合缺失（Klotho+/-）小鼠模型中的軟骨情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜合性缺失的年輕和中年雄性小鼠存在加速的軟骨退化，而在雌性Klotho+/-小鼠中，并未觀察到加速的軟骨退化。鑒于這種性別間的差異，作者認(rèn)為α-Klotho或許是一個(gè)性別依賴的、衰老相關(guān)膝關(guān)節(jié)炎的驅(qū)動(dòng)因子?？紤]到在雌性小鼠上只呈現(xiàn)了有限的疾病表型，作者只使用雄性小鼠進(jìn)行后續(xù)研究。
4. 年齡相關(guān)的α-Klotho減少與小鼠和人軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核機(jī)械力學(xué)相關(guān)
前面蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果顯示，在年老的小鼠軟骨中機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)發(fā)生擾動(dòng)。這促使作者思考衰老相關(guān)的α-Klotho減少是不是微環(huán)境中改變的機(jī)械信號(hào)導(dǎo)致的結(jié)果。
衰老與細(xì)胞核機(jī)械力學(xué)以及核被膜功能障礙的進(jìn)行性改變相關(guān)，這將驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)重塑和基因表達(dá)改變。核被膜主要由核纖層（比如，lamin A/C和lamin B）和一個(gè)雙層膜通過(guò)核骨架和細(xì)胞骨架復(fù)合物的連接組成。特別的是，lamin A/C是一個(gè)已知的細(xì)胞核完整性調(diào)節(jié)因子。作者回溯蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與年輕小鼠相比，年老小鼠的纖層蛋白laminA/C和B2的蛋白質(zhì)豐度顯著增加。
為了進(jìn)一步表征年齡相關(guān)的核被膜變化，作者量化了軟骨組織中的軟骨細(xì)胞核形態(tài)，包括大小、形狀、強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)。53個(gè)形態(tài)學(xué)變量的主成分分析(PCA)顯示年輕和年老軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核明顯分離。
在影響第一主成分的前10個(gè)變量中，核離心率（eccentricity）或球形度被發(fā)現(xiàn)是小鼠和人類樣本中與衰老相關(guān)的高度敏感的核形態(tài)標(biāo)志物。值得注意的是，核離心率（eccentricity）的增加(即球形核的減少)也與α-Klotho蛋白水平的降低顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明α-Klotho水平的下降可能歸因于細(xì)胞核機(jī)械力學(xué)的改變。
5. 基質(zhì)硬度上升誘導(dǎo)α-Klotho減少并導(dǎo)致年輕軟骨細(xì)胞產(chǎn)生一種衰老的表型
細(xì)胞核與微環(huán)境機(jī)械力學(xué)關(guān)聯(lián)，在微環(huán)境中，細(xì)胞骨架元件會(huì)根據(jù)外部ECM硬度情況調(diào)節(jié)細(xì)胞核形狀。于是，作者進(jìn)一步研究ECM硬度上升對(duì)軟骨細(xì)胞表型的直接影響。作者將原代軟骨細(xì)胞“種植”在不同硬度（5kPa、21kPa和100kPa）的聚丙烯酰胺（polyacrylamide，pAAm）凝膠上。與生長(zhǎng)在較軟基質(zhì)上的細(xì)胞相比，生長(zhǎng)在較硬基質(zhì)上的年輕軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)一種年老的表型，II型膠原蛋白和聚蛋白多糖表達(dá)下調(diào)，同時(shí)伴隨著α-Klotho的表達(dá)下調(diào)。而生長(zhǎng)在較軟基質(zhì)上的年老軟骨細(xì)胞中，以上幾個(gè)蛋白的表達(dá)則上調(diào)。
為了檢測(cè)基質(zhì)硬度是否直接通過(guò)α-Klotho調(diào)控軟骨形成，作者對(duì)生長(zhǎng)在軟基質(zhì)上的年輕軟骨細(xì)胞進(jìn)行敲低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA導(dǎo)致的α-Klotho敲低產(chǎn)生的影響超過(guò)了軟基質(zhì)的促軟骨形成能力，表現(xiàn)為II型膠原蛋白和聚蛋白多糖的下調(diào)。
作者繼續(xù)在3D微環(huán)境驗(yàn)證上述現(xiàn)象是否依然存在。結(jié)果顯示，和2D的生長(zhǎng)環(huán)境一致，在3D微環(huán)境下，年輕軟骨細(xì)胞在一個(gè)硬的3D微環(huán)境中也出現(xiàn)了下調(diào)的α-Klotho和II型膠原蛋白。總體，2D和3D的結(jié)果表明，軟的基質(zhì)能促進(jìn)年老軟骨細(xì)胞有一種更年輕的表型，而硬的基質(zhì)則會(huì)加速時(shí)間對(duì)年輕軟骨細(xì)胞的影響。
6. 基質(zhì)硬度通過(guò)表觀調(diào)控α-Klotho的表達(dá)
已知機(jī)械力誘導(dǎo)核染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和表觀特征來(lái)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。因此，研究者檢測(cè)硬的基質(zhì)導(dǎo)致的α-Klotho缺失是否是由表觀修飾介導(dǎo)的。作者檢測(cè)了在不同硬度基質(zhì)上生長(zhǎng)的年輕或年老的軟骨細(xì)胞中Klotho基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化。結(jié)果顯示，硬的基質(zhì)條件下，年輕軟骨細(xì)胞Klotho基因啟動(dòng)子甲基化增加，α-Klotho表達(dá)下調(diào)。相反地，軟的基質(zhì)顯著降低Klotho基因啟動(dòng)子甲基化，上調(diào)α-Klotho表達(dá)。此外，在軟的基質(zhì)促進(jìn)了年輕和年老軟骨細(xì)胞的總體DNA甲基化，程度相比Klotho基因啟動(dòng)子甲基化要低。硬度依賴的Klotho基因啟動(dòng)子甲基化也被隨著基質(zhì)硬度升高軟骨細(xì)胞中升高的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1表達(dá)所印證。
隨后，作者通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)確認(rèn)ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）硬度增加與上升的DNMT1和Klotho基因啟動(dòng)子結(jié)合有關(guān)。同時(shí)，作者檢測(cè)到Klotho基因轉(zhuǎn)錄減弱。另一個(gè)ChIP實(shí)驗(yàn)明確了硬的基質(zhì)是通過(guò)在DNMT1啟動(dòng)子區(qū)招募Pol II、H3K4M2，而非H3K9M2，最終引起DNMT1表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了c-MYC與DNMT1啟動(dòng)子的結(jié)合。C-MYC是個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，受到激酶信號(hào)刺激或調(diào)控。總體這些發(fā)現(xiàn)表明，DNMT1是與硬度介導(dǎo)的信號(hào)直接相關(guān)的基因。
作者通過(guò)siRNA敲低DNMT1的表達(dá)，DNMT1被抑制后，硬的基質(zhì)對(duì)軟骨細(xì)胞中α-Klotho的表達(dá)和軟骨生成的下調(diào)作用被挽救。此外，作者還確認(rèn)了，硬的基質(zhì)介導(dǎo)的軟骨生成下降是通過(guò)抑制Klotho實(shí)現(xiàn)的。
由于來(lái)自微環(huán)境的外部機(jī)械信號(hào)通過(guò)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架傳遞到細(xì)胞核，作者接下來(lái)檢測(cè)細(xì)胞骨架的破壞是否抑制硬的基質(zhì)對(duì)下游軟骨細(xì)胞反應(yīng)的影響。作者使用肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑lat A處理在硬的基質(zhì)上培養(yǎng)的老化細(xì)胞。lat A消除了應(yīng)力纖維的形成，降低了核離心率(即增加了細(xì)胞核圓度)，并降低了lamin A/C的表達(dá)，而不影響軟骨細(xì)胞的活力。肌動(dòng)蛋白聚合的減少降低了DNMT1的表達(dá)，增加了α-Klotho水平，最終恢復(fù)了II型膠原蛋白和聚蛋白多糖水平。
lat A處理后α-Klotho水平的增加也伴隨著Klotho啟動(dòng)子甲基化水平的降低，但全局DNA甲基化沒(méi)有顯著改變。有趣的是，硬的基質(zhì)引起的Dnmt1啟動(dòng)子上Pol II和c-MYC結(jié)合的增加在lat A處理?xiàng)l件下被消除。因此，作者認(rèn)為Klotho/Dnmt1的轉(zhuǎn)錄機(jī)制可能受到機(jī)械信號(hào)的表觀遺傳調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞在硬的基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，lat A處理也消除了Pol II、H3K4M2和DNMT1在Klotho啟動(dòng)子處結(jié)合的變化。使用肌動(dòng)蛋白纖維形成的抑制劑Y-27632或粘附斑激酶抑制劑PF-562271同樣消除了生長(zhǎng)在硬的基質(zhì)上的軟骨細(xì)胞中DNMT1的增加和α-Klotho的減少。
7. 降低ECM硬度可增加α-Klotho的表達(dá)并改善衰老小鼠的軟骨健康
前述結(jié)果提高了通過(guò)阻止或者反轉(zhuǎn)基質(zhì)變硬的靶向ECM機(jī)械力學(xué)策略來(lái)治療衰老相關(guān)膝關(guān)節(jié)炎的可能性。作者回看了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基于155個(gè)ECM蛋白的PCA分析結(jié)果中，年老軟骨的ECM相關(guān)蛋白的表達(dá)譜發(fā)生了改變。賴氨酰氧化酶(LOX)出現(xiàn)在對(duì)PC2有貢獻(xiàn)的前20個(gè)蛋白質(zhì)中，并與纖層蛋白lamin A/C正相關(guān)?？紤]到LOX是參與膠原交聯(lián)的主要酶之一，并已被證明通過(guò)增加ECM硬度來(lái)促進(jìn)PTOA（創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎），因此LOX引起了作者的興趣。
隨著年齡增長(zhǎng)，軟骨硬度增加2-3倍。作者檢測(cè)是否可通過(guò)降低年老小鼠的軟骨硬度來(lái)改善α-Klotho水平和軟骨完整性。作者使用已知的LOX抑制劑β-氨基丙/*(BAPN)降低年老小鼠軟骨硬度。連續(xù)四周每天注射BAPN可顯著降低脛骨內(nèi)側(cè)軟骨的硬度。組織學(xué)分析表明，使用BAPN治療的年老小鼠的軟骨細(xì)胞顯示出與年輕小鼠類似的更球形的細(xì)胞核形態(tài)。PCA分析進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)BAPN處理的年老小鼠的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出更年輕的表型。此外，與體外研究結(jié)果一致，在體內(nèi)降低年老軟骨的基質(zhì)硬度可顯著提高α-Klotho水平并改善軟骨完整性。然而，在Klotho+/?小鼠中未觀察到BAPN對(duì)軟骨完整性的有益影響，說(shuō)明注射BAPN后軟骨完整性的改善至少部分是由增加α-Klotho水平所驅(qū)動(dòng)的。
研究總結(jié)
作者通過(guò)觀測(cè)不同年齡段小鼠軟骨情況發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增大，軟骨退化程度和表面粗糙程度增加。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)找到了隨著年齡增長(zhǎng)顯著擾動(dòng)的PI3K/Akt信號(hào)通路，并通過(guò)分析鎖定了一個(gè)調(diào)控因子α-Klotho。隨著年齡增大，α-Klotho蛋白表達(dá)下降，且α-Klotho雜合性缺失會(huì)加速雄性小鼠的軟骨退化。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，衰老誘導(dǎo)的α-Klotho下降與細(xì)胞核機(jī)械力學(xué)相關(guān)，進(jìn)而關(guān)聯(lián)到細(xì)胞外基質(zhì)。深入的機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)硬度的增加驅(qū)動(dòng)了Klotho啟動(dòng)子甲基化，下調(diào)Klotho基因表達(dá)，并加速體外軟骨細(xì)胞衰老。而將老化的軟骨細(xì)胞暴露在柔軟的基質(zhì)中，則能恢復(fù)更年輕表型，并增強(qiáng)體內(nèi)軟骨的完整性。作者的研究結(jié)果表明，與年齡相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)生物物理特性的改變啟動(dòng)了致病的機(jī)械傳導(dǎo)信號(hào)，促進(jìn)Klotho啟動(dòng)子甲基化并損害細(xì)胞健康。作者的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)超出軟骨領(lǐng)域，對(duì)衰老研究領(lǐng)域也產(chǎn)生影響。
吉?jiǎng)P基因憑借多年在靶標(biāo)篩選及驗(yàn)證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標(biāo)準(zhǔn)化 、工程化 、系統(tǒng)化的GRP平臺(tái)，為中國(guó)研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化。其中，多組學(xué)平臺(tái)包含蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)和高通量測(cè)序平臺(tái)：
·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)擁有多臺(tái)timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專業(yè)的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質(zhì)組等檢測(cè)服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測(cè)序平臺(tái)分為常規(guī)測(cè)序服務(wù)和單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)：單細(xì)胞測(cè)序擁有10x和BD兩個(gè)平臺(tái)，提供單細(xì)胞RNA-seq、單細(xì)胞核測(cè)序、單細(xì)胞混樣RNA-seq、單細(xì)胞TCR/BCR、單細(xì)胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等服務(wù)；常規(guī)測(cè)序服務(wù)提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測(cè)序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修飾測(cè)序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測(cè)序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（兩文庫(kù)/三文庫(kù)）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務(wù)。