近日，復旦大學生科院盧大儒教授團隊在《Human Genetics》上發表了《CRISPR/Cas9-mediated somatic and germline gene correction to restore hemostasis in hemophilia B mice》，文章揭示了在血友病B（Hemophilia B）型小鼠中，CRISPR/Cas9能夠通過介導基因修復，重塑小鼠的凝血功能。
血友病B（HB）是研究基因治療的理想模型。HB是一種X染色體遺傳的血液性疾病，是由于凝血因子FIX（F9編碼的凝血因子，F9 encoded coagulation factor IX）的功能性缺失導致的。最初治療HB采用的是凝血因子補充療法（通過濃縮或者重組FIX），然而，FIX的半衰期只有24h，因此，基因治療可能是更加適合的治療方法。傳統的基因治療方法是通過病毒將F9基因轉染到動物或病人的肝臟、肌肉、成纖維細胞中，然而，由于病毒載體所帶來的毒性仍在評估，并且存在基因組整合的風險，因此基因的定點修復是研究基因治療的理想模型。
當外源提供donorDNA模板時，突變的DNA位點處可以通過同源重組（homology directed repair，HDR）進行修復。機體自發的HDR頻率較低，只有1×10?6，而CRISPR/Cas9可以增加HDR的幾率。由于CRISPR/Cas9具有基因編輯效率高、可操作性高、成本低等明顯優勢，現在已經被廣泛應用于小鼠胚胎、細胞系、誘導多能干細胞等DNA突變的HDR。CRISPR/Cas9基因編輯系統在基因治療上具有廣闊的前景。
盧教授團隊選取了患有嚴重血友病的小鼠作為研究對象，對成年小鼠進行尾靜脈注射（hydrodynamic tail vein，HTV）導入Cas9表達質粒，其凝血功能得到了部分緩解。體外顯微注射小鼠的生殖細胞時，Cas9蛋白更為安全，并且具有較高的修復效率。
盧教授團隊首先突變了小鼠的第8個外顯子，在高度保守的結構域中造成了8bp的缺失，使得FIX無法活化，突變后的小鼠被稱為F9 KO 小鼠。mRNA和蛋白水平上的研究標明，F9 KO 小鼠可以用作研究HB的理想模型。
肝臟是唯一表達FIX的器官，將Cas9-sgRNA和donor DNA的質粒通過HTV的方式導入小鼠的肝細胞。6周后進行檢測。結果表明，與對照組小鼠（只注射了donor DNA）相比，75%的實驗組小鼠基因得到了修復，而對照組小鼠的基因修復率為0%。此外，實驗組小鼠的F9基因在血漿和肝臟中的表達量是對照組小鼠的3.39倍。Cas9-HTV處理的小鼠血漿中，FIX的含量增加至正常水平，也顯示了較好的治療效果。
HB小鼠經過Cas9-DNA轉染處理后，基因被修復，但是這種被修復的性狀不能遺傳。為了比較不同的Cas9形式對基因修復效率和安全性的影響，盧教授團隊將Cas9的三種形式，Cas9 mRNA，Sp Cas9蛋白（Cas9-wt）和高保真的Sp Cas9蛋白(Cas9-HF)，顯微注射進F9 KO小鼠的胚胎中。培養2天后，更多注射了Cas9蛋白的胚胎發育為囊胚，且出生率是注射mRNA的1.56倍，該試驗結果也表明Cas9蛋白的注射方式對胚胎的毒性更小。
同時，注射Cas9蛋白的基因修復效率較高。測序結果顯示，注射了Cas9-wt的胚胎中，52.6%的F9基因得到了修復，是注射了Cas9 mRNA的1.62倍。此外，70%的注射了Cas9-wt的胚胎發生了純合/雜合修復，意味著它們可能產生沒有缺陷基因的配子。Cas9-HF實驗組胚胎的成活率和基因修復也明顯高于Cas9 mRNA實驗組，但DNA修復效率略低于Cas9-wt實驗組胚胎。檢測新生小鼠的治療效果，與F9 KO小鼠相比，注射了Cas9的小鼠的FIX濃度更高，暗示了Cas9介導的基因治療方法效果卓然。
盧教授團隊不僅揭示了CRISPR/Cas9可以通過基因編輯對基因進行修復，在基因治療領域有著更廣闊的前景，也證明了與Cas9的其他形式相比，Cas9蛋白有更高的修復效率以及更低的胚胎毒性。