iTRAQ技術(shù)是目前比較成熟且常用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在尋找疾病蛋白質(zhì)biomarkers的研究中經(jīng)常用到該技術(shù)。尋找蛋白質(zhì)biomarkers的研究經(jīng)常分為兩部分：一為通過差異定量的方法高通量篩選，并利用生物信息學(xué)的手段縮小候選驗(yàn)證的范圍；二為利用各種驗(yàn)證手段對前期高通量篩選的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出最具有潛力的候選biomarkers，以供更進(jìn)一步地臨床分析。
本篇文獻(xiàn)里作者先是采用基于質(zhì)譜的高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)——iTRAQ，篩選出與結(jié)腸癌診斷相關(guān)的biomarkers，接著分別通過免疫組化、QPCR、多例病例的數(shù)據(jù)集等研究對篩選的候選蛋白質(zhì)biomarkers進(jìn)行驗(yàn)證，最終認(rèn)為LOXL2是最具有潛力的診斷標(biāo)志物。
文獻(xiàn)來源：LOXL2 is highly expressed in cancer-associated fibroblasts and associates to poor colon cancer survival. Clin Cancer Res. 2015 Jul 23. pii: clincanres.3096.2014.
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對結(jié)腸癌發(fā)展不同階段的正確區(qū)分（尤其是II期和III期），迫切需要尋找到足夠多的診斷標(biāo)志物。腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境的主要參與者，與腫瘤的復(fù)發(fā)和存活密切相關(guān)。作者利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（iTRAQ）分析了從腫瘤病人組織中分離純化出的結(jié)腸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）與正常成纖維細(xì)胞（NFs）的蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)大量間質(zhì)相關(guān)蛋白可能作為診斷標(biāo)志物。其中LOXL2和TAGLN表現(xiàn)出很強(qiáng)的診斷價(jià)值，LOXL2的高表達(dá)與較差的預(yù)后直接相關(guān)，并能夠很好地指針高風(fēng)險(xiǎn)的II期和III期病人。LOXL2可能在臨床應(yīng)用中具有很好的風(fēng)險(xiǎn)評估潛力，有利于判斷后續(xù)治療策略及改善最終的預(yù)后。
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收集12對結(jié)腸癌病人的腫瘤組織及癌旁組織，將腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）與正常成纖維細(xì)胞（NFs）進(jìn)行純化分離，利用4-Plex iTRAQ對成纖維細(xì)胞的細(xì)胞上清和胞內(nèi)蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。差異表達(dá)的間質(zhì)相關(guān)蛋白隨后進(jìn)一步利用免疫組化進(jìn)行驗(yàn)證。預(yù)后診斷潛力評價(jià)過程中，① 外源基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（共包含超過300例病人的數(shù)據(jù)）被用于進(jìn)行訓(xùn)練和風(fēng)險(xiǎn)界定，② 70例病例組織的PCR結(jié)果以及 ③ 121例病例組織的免疫組化結(jié)果被用于進(jìn)行驗(yàn)證。整合的數(shù)據(jù)集被用于對II期和III期病人進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測。
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iTRAQ workflow used for the proteomic analysis of CAFs and NFs.
CM: Cell Conditioned Medium WCE: Whole Cell Extract
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iTRAQ分別鑒定到1780個(gè)胞內(nèi)和305個(gè)細(xì)胞上清蛋白，其中分別有57 和43蛋白具有表達(dá)差異，作者選擇了其中15個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了WB和PCR驗(yàn)證。體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β刺激后，表現(xiàn)出了相似的蛋白表達(dá)譜。
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Proteins identified and quantified in both iTRAQ replicates. About 78% of identified proteins and 82% of quantified proteins were coincident in both analyses.
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Figure 1. Validation of CAFs deregulated proteins. (A) Whole cellular extracts or concentrated protein samples from conditioned medium of CAFs and NFs were separated on SDS-PAGE gels, transferred to nitrocellulose membranes and probed with the indicated antibodies. Tubulin was used as a loading control. Protein abundance was quantified by densitometry to compare the expression with the iTRAQ ratios. (B) cDNAs synthesized from total RNA obtained from NFs and CAFs were subjected to QRT-PCR using specific primers for the selected genes and 18S rRNA for normalization. BJh-TERT cells were starved in serum-free medium, treated with TGFβ (5 ng/mL) for 24 h and lysed. The extracts were analyzed by QPCR (C) and Western blot (D) using specific primers and the indicated antibodies. Data represent the mean ± SD of three experiments. (*, p < 0.05, **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
（以下幾段均為通過不同方法對iTRAQ結(jié)果中篩選的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證）
為了分析這些差異表達(dá)蛋白的細(xì)胞表達(dá)特異性，作者采用了GSE39396 dataset（從6個(gè)結(jié)腸癌病人分離得到的4種細(xì)胞endothelial cells: CD31+, epithelial cells: EPCAM+, inflammatory cells: CD45+ and CAFs: FAP+）進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)其中60個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白中的28個(gè)蛋白，以及40個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白中的24個(gè)蛋白，與成纖維細(xì)胞的高表基因狀態(tài)一致。
接下來，作者用QPCR的方法分析了這些蛋白在KM12C、KM12SM、SW480 和SW620上皮結(jié)腸癌細(xì)胞系中的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中的10個(gè)蛋白特異性地或者過表達(dá)于成纖維細(xì)胞中。
免疫組化試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，ACAN、αSMA、CDH13、DKK3、TAGLN、TGM2和LOXL2均選擇性表達(dá)于結(jié)腸癌間質(zhì)中，而在上皮或正常的結(jié)腸黏膜中不表達(dá)或無規(guī)律性表達(dá)。這些結(jié)果說明，篩選出的蛋白具有作為特異性腫瘤間質(zhì)標(biāo)志物的價(jià)值。
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為了評估這些蛋白是否能夠指針疾病的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，作者首先在一個(gè)由70例結(jié)腸癌病人組成的隊(duì)列中進(jìn)行了驗(yàn)證。腫瘤組織中的LOXL2表達(dá)水平比正常組織高出44%，LOXL2的高表達(dá)與整體存活（P = 0.001 HR: 8.52 (1.90-38.29)）和高復(fù)發(fā)率（P = 0.001 HR: 5.38 (1.70-17.01)）一致。
多變量統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)集的結(jié)果證實(shí)，LOXL2的表達(dá)水平與較差的預(yù)后相關(guān)，并可作為一個(gè)獨(dú)立的無疾病存活和整體存活的預(yù)后因子（Table 1）。
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隨后，另外一批121個(gè)結(jié)腸癌病人的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，大約32%的病人表現(xiàn)出較強(qiáng)的LOXL2表達(dá)（>50%的陽性標(biāo)記），間質(zhì)細(xì)胞核的陽性標(biāo)記與無疾病存活和整體存活有關(guān)。將LOXL2和其他標(biāo)志物進(jìn)行組合診斷，并不能明顯提高診斷能力。
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為了評價(jià)LOXL2對II期和III期病人的風(fēng)險(xiǎn)評估價(jià)值，作者采用多個(gè)數(shù)據(jù)集分析了II期病人的復(fù)發(fā)率與表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LOXL2高表達(dá)的II期病人的復(fù)發(fā)周期更短（P value = 0.011 HR: 2.74 (1.22-6.20)），其三年DFS為73.9%，而低表達(dá)組為89.6%。高表達(dá)LOXL2的47例II期和III期病人的無病期更短。55個(gè)II期病人的免疫組化結(jié)果顯示，其無病期為P= 0.005 HR: 4.35 (1.43-13.25)。LOXL2高表達(dá)也與III期病人的整體存活（P = 0.004 HR: 3.40 (1.40-8.24)）有關(guān)。
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通過蛋白質(zhì)組學(xué)的篩選和后續(xù)驗(yàn)證，該研究證實(shí)LOXL2的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的預(yù)后有關(guān)，并可通過區(qū)分II期和III期階段為后續(xù)的治療決策提供幫助。
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