在活體動物上 “看透” 大腦、骨骼、腫瘤、腸道等深層組織，實時捕捉細胞運動、血流變化、分子轉運，已成為生命科學研究的核心剛需。傳統顯微鏡穿透淺、光損傷大、無法長時程觀測，而雙光子成像技術，憑借非線性光學原理，成為活體深層成像的金標準。
本文從定義原理、儀器介紹、可做實驗、樣品制備、應用方向、經典案例全方位解析，幫你一次性搞懂雙光子熒光成像。
雙光子成像：標準定義與科學原理
雙光子成像是基于雙光子激發熒光的非線性光學顯微成像技術：熒光分子在聚焦激光焦點處同時吸收兩個近紅外長波長光子，被激發后釋放熒光信號。該技術實現了高分辨率、深組織穿透、低光損傷、高信噪比的活體成像，是目前小鼠活體深層動態觀測的最優方案。
• 激發光源：680-1300 nm 近紅外飛秒激光，組織散射低、穿透能力強
• 激發特點：僅焦點處產生信號，非聚焦區域無光漂白、無光毒性
• 成像優勢：背景極低、分辨率高、可進行毫米級深度成像
• 輸出能力：支持二維成像、Z?stack 三維重構、長時間動態視頻
• 穿透深度高：最高可達 1000 μm，可直接觀測大腦、骨骼、肝臟、腸道、腫瘤等深層結構
• 光損傷極低：適合活體數小時至數周長時程動態觀測
• 空間分辨率高：亞微米級清晰度，可分辨單個細胞、突起、微血管
• 三維重構能力強：逐層掃描生成立體結構，支持定量分析
• 兼容性廣：可搭配熒光蛋白、熒光探針、熒光染料、熒光藥物使用
它長啥樣？
核心硬件配置
它能幫你破什么案？
真實戰例
●小鼠活體腦血流成像
模型：小鼠顱窗模型
標記：FITC?dextran 血管熒光標記
觀測內容：大腦皮層微血管結構、血流速度、血流灌注區域
應用方向：腦缺血、腦卒中、神經功能、血腦屏障研究
●類器官 & 腸道組織三維成像
樣本：腦類器官、肝類器官、腸類器官、腫瘤類器官
觀測內容：內部結構、細胞分層、分化狀態、熒光標記定位
應用方向：類器官發育、疾病模型構建、藥物篩選與毒性評價
左圖：小鼠活體腦血流成像
出處：Nov;27(11):2086-2100. doi: 10.1038/s41593-024-01753-w
右圖：小鼠腸道空腔三維圖像
• 活體小鼠，麻醉、保溫、固定體位后直接上機
• 尾靜脈注射熒光探針（FITC?dextran、NBD-膽固醇等）
• 全程保持活體狀態，不處死、不解剖
• 新鮮組織快速取材
• 直接制備冰凍切片，厚度不大于50 μm
• PBS 洗凈，不要完全干透
• 輕蓋蓋玻片，避免產生氣泡
• 蓋玻片四周用指甲油封邊
• 新鮮類器官直接制片
• 滴加少量 PBS 保持濕潤
• 直接上機進行 Z?stack 3D 掃描
• 活體動物：提前預約，按約定時間活體送達
• 切片 / 類器官：干冰低溫運輸，密封防潮、避免反復凍融
雙光子活體熒光成像，是當前活體深層動態研究不可替代的核心技術。Nikon AX R MP 多光子成像系統以穩定、高效、高分辨的表現，成為高分文章與重大科研項目的標配平臺。
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下一期，我們將為大家深入剖析本期儀器的另一種極具特色的使用方法 ——SHG 二次諧波無標記成像！
這種成像技術無需使用傳統的熒光標記物，卻能憑借獨特的光學原理，實現對生物組織精細結構的清晰成像。在后續內容里，我們會從原理闡釋、操作要點，到實際應用案例等方面，全方位為你解讀 SHG 二次諧波無標記成像，帶你領略它在科研探索中的獨特魅力與強大效能。
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