編者按
肝臟是人體最大的實(shí)質(zhì)內(nèi)臟器官，參與多種過(guò)程，包括許多血漿蛋白的合成、維持恒定的血糖水平、新陳代謝、藥物解毒和酶的產(chǎn)生。然而，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肝臟相關(guān)的慢性疾病越來(lái)越多，并且藥物的肝毒性也引起了科研人員的重視，因此一個(gè)能夠高度模擬體內(nèi)環(huán)境的體外肝臟模型將大大促進(jìn)這方面研究的進(jìn)展。而來(lái)源于hiPSC的肝類器官模型，包含多種肝臟中的細(xì)胞類型，盡可能地模擬了人體內(nèi)肝臟的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，大大助力了肝臟相關(guān)的疾病建模、遺傳研究和藥物篩選等研究。
今天，我們特別關(guān)注一項(xiàng)于2023年9月發(fā)表在《Experimental & Molecular Medicine》的經(jīng)典研究——Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human PSCs，該研究報(bào)告了一種用于生成血管化肝類器官的方法，并提出了誘導(dǎo)分化過(guò)程中的步驟，培養(yǎng)基配比以及細(xì)胞類型的鑒定方法等，為細(xì)胞治療、組織工程、藥物毒性評(píng)估和疾病建模等應(yīng)用提供了新的工具和平臺(tái)。
文章題目
Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human PSCs
雜志：Experimental & Molecular Medicine（IF=9.5）
發(fā)表時(shí)間：2023.9.1
作者：Sean P. Harrison, Richard Siller, Gareth .Sulivan等
01、研究背景
肝臟是人體最大的內(nèi)分泌器官，對(duì)維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要，是異物代謝、凝血因子生成、氨清除以及其他多種基本功能的主要場(chǎng)所。對(duì)于肝衰竭，除了肝移植（LTX）外，沒有其他治療方法。此外，評(píng)估肝臟代謝和藥物毒性等的黃金標(biāo)準(zhǔn)是原代人類肝細(xì)胞（PHHs）。然而，PHHs 的供應(yīng)極為有限，而且在體外會(huì)迅速喪失功能。這一問(wèn)題表明需要尋找潛在的替代品來(lái)填補(bǔ)這一空白，提供一個(gè)穩(wěn)定、可擴(kuò)展和基因定義的替代方案。
在本文中，研究人員詳細(xì)的介紹了一種利用人類多能干細(xì)胞（hPSCs）構(gòu)建肝類器官的新方法。與傳統(tǒng)方法相比，該方法不需要2D形態(tài)構(gòu)建，不依賴于昂貴的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)，而是利用hPSCs在懸浮培養(yǎng)中自聚集形成3D結(jié)構(gòu)。所得的肝類器官具有類似肝臟的細(xì)胞組成和功能，包括肝臟特異性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和功能性。此外，這些器官樣結(jié)構(gòu)還可以用于研究凝血機(jī)制，并提供了一種潛在的細(xì)胞治療方法的基礎(chǔ)。
02、研究結(jié)果
1. 肝類器官誘導(dǎo)分化方案
hPSCs來(lái)源的多細(xì)胞肝類器官的分化過(guò)程，模擬了體內(nèi)發(fā)育的各個(gè)階段，如下圖所示：
圖1
2. iPSC來(lái)源的肝類器官的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究人員對(duì)人類多能干細(xì)胞（hPSCs）來(lái)源的肝類器官進(jìn)行了細(xì)胞多樣性的分析。他們發(fā)現(xiàn)了三個(gè)肝細(xì)胞聚類（HEP1-3），其中表達(dá)了甘油脂或膽固醇代謝基因。
進(jìn)一步通過(guò)基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，這些肝細(xì)胞聚類顯示出不同程度的門脈區(qū)基因特征富集，表明類器官中存在肝細(xì)胞基因表達(dá)的區(qū)域性差異。然而，相比于成熟的肝臟，這些肝類器官中的區(qū)域性基因表達(dá)水平較低，可能因?yàn)樗鼈兡M了早期發(fā)育中的肝臟狀態(tài)。
圖2
3. iPSC來(lái)源的肝類器官的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
研究人員通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)在肝類器官和人類肝臟中存在相似的關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)，涉及到血液凝固和氨基酸代謝等多種代謝途徑和功能。然后，通過(guò)無(wú)偏聚類分析，發(fā)現(xiàn)肝類器官和肝臟的蛋白質(zhì)表達(dá)模式存在顯著差異，特別是在與血液細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)上。這項(xiàng)研究揭示了肝類器官的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，為進(jìn)一步理解其功能和應(yīng)用提供了重要參考。
圖3
4. iPSC來(lái)源的肝類器官含有肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞
研究人員通過(guò)免疫熒光染色驗(yàn)證了肝類器官的復(fù)雜性和成熟度，顯示了肝細(xì)胞的特征，包括谷氨酰胺合成酶（GS）、羧基安氨酸合酶（CPS1）和肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子HNF4α的表達(dá)。這些標(biāo)記物的存在表明肝類器官已經(jīng)超越了胎兒階段的發(fā)育，進(jìn)入了更成熟的階段。
此外，還檢測(cè)到成人肝細(xì)胞和成熟標(biāo)記物如CYP2A6和ASGR1的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了肝類器官的成熟度。
圖4
5. iPSC來(lái)源的血管化肝類器官
研究人員通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序分析確定的內(nèi)皮細(xì)胞群，并使用CD31抗體驗(yàn)證了肝類器官內(nèi)血管的存在。通過(guò)體積渲染的三維重建圖展示了具有中等直徑的血管腔，并且這些血管在尺寸上與毛細(xì)血管相符。
圖5
6. iPSC來(lái)源的肝類器官具有肝臟功能
研究人員發(fā)現(xiàn)人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的肝類器官具有類似于肝臟的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)譜，并且展示了類似于肝臟的細(xì)胞組成。通過(guò)對(duì)其功能進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)這些肝類器官顯示出肝臟的功能，包括藥物代謝能力。
相比于二維培養(yǎng)中的肝細(xì)胞，這些肝類器官具有更高水平的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)的藥物代謝活性，并且在長(zhǎng)期培養(yǎng)中保持了這種活性。這些發(fā)現(xiàn)為肝臟疾病建立模型以及開發(fā)新的藥物篩選平臺(tái)提供了潛在的工具。
圖6
7. iPSC來(lái)源的肝類器官分泌血漿蛋白，具有功能性凝血機(jī)制
研究人員對(duì)肝類器官進(jìn)行了分析，證明其在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上表現(xiàn)出類似肝臟的特征，這些肝類器官不僅具有肝細(xì)胞特征，還顯示出肝細(xì)胞的極化特征，并且含有膽管細(xì)胞。此外，研究證實(shí)了這些肝臟類具有肝臟功能，如藥物代謝和血清蛋白的產(chǎn)生。通過(guò)RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)了維生素K依賴性凝血因子、內(nèi)源性抗凝劑以及其他凝血因子的表達(dá)。
圖7
02、編者點(diǎn)評(píng)
總的來(lái)說(shuō)，本文描述了一種能夠生成大量功能成熟的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hPSC）來(lái)源的肝類器官的方法。該方法產(chǎn)生的肝類器官遵循肝臟類似的發(fā)育途徑，包含肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞等肝樣細(xì)胞群，并且還包含非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如肝星狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞群等。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化等方法驗(yàn)證了這些肝類器官的肝樣特征。
此外，研究還觀察到肝類器官內(nèi)的血管化現(xiàn)象，并展示了其具有肝臟功能特征，包括產(chǎn)生血清蛋白、凝血因子和支持尿素生成等功能。研究還證明這些肝類器官可成功移植到小鼠體內(nèi)，并表現(xiàn)出人類白細(xì)胞介素CD31陽(yáng)性內(nèi)皮結(jié)構(gòu)。這種大量生產(chǎn)的肝類器官將為疾病建模、了解再生過(guò)程以及潛在的治療手段提供有力工具。雖然目前存在一些挑戰(zhàn)，但這種方法有望成為臨床和篩選平臺(tái)的重要資源。未來(lái)，這些器官將有助于研究發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞相互作用以及毒性學(xué)和藥物篩選等領(lǐng)域。
這是一項(xiàng)非常值得閱讀的類器官研究，適合每一位想要開展“血管化肝類器官相關(guān)研究”的學(xué)者拜讀，文中提出了誘導(dǎo)分化過(guò)程中的步驟，培養(yǎng)基配比以及細(xì)胞類型的鑒定方法等。這項(xiàng)研究為細(xì)胞治療、組織工程、藥物毒性評(píng)估和疾病建模等應(yīng)用提供了新的工具和平臺(tái)。
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