腦膜瘤（Meningiomas，MGMs）由腦膜皮細胞（蛛網膜細胞）構成的腫瘤，發生于硬腦膜內表皮，是常見的中樞神經系統腫瘤。多分布在高領人群中，且女性發病率為男性的2.3倍。腦膜瘤WHO分為3級，臨床中80%-90%的腦膜瘤都屬于良性，也就是屬于WHO分級中的Ⅰ級。但在臨床中也有5%-15%的腦膜瘤是屬于WHO分級當中的Ⅱ級。1%-3%的腦膜瘤屬于分化不良型，也就是在WHO分級中屬于Ⅲ級，基本屬于惡性腫瘤，而且后期復發的風險非常高，預后不良。
通常情況下WHO分級在Ⅱ-Ⅲ的腦膜瘤稱為侵襲性腦膜瘤。治療方法包括手術和放化療相結合。盡管該方法在其他實體腫瘤中成功率很高，但在腦膜瘤患者中進行化療并未顯示出明顯療效。因此，新型治療方式，例如免疫療法的研究是十分必須的。腫瘤浸潤性T淋巴細胞（tumor-infiltrating T-lymphocytes ，TIL）在免疫治療中起著至關重要的作用。
實驗中對202例臨床病例——123例原發性腦膜瘤（Primary Meningiomas，pMGM）和79例復發性腦膜瘤(Recurrent Meningiomas, rMGM）——中TIL含量進行定量分析，其中MGM的WHO高分型為97例 WHO°II，62例 WHO°III。組織樣本標記為CD3，CD8，FOXP3和PD-1免疫熒光染色。
本文中海德堡大學醫院神經外科的Dr Christel Herold-Mende及其團隊評估了臨床樣本中TIL含量及其在pMGM和rMGM中的活化狀態及其預后影響。文章發表在Clinical Cancer Research。通過定量分析發現，t細胞浸潤極為不均勻，范圍為0.01 - 24.88%，其中中位T細胞浸潤占總細胞數量的0.59%。盡管在原發性腦膜瘤中輔助T細胞（CD3+CD8-FOXP3-）和細胞毒性T細胞（CD3+CD8+FOXP3-）沒有發生明顯的WHO分型變化，但較高數量的細胞毒性TILs與無進展生存(PFS)的改善相關，而不受預后混雜因素的影響。 復發性腦膜瘤的特征是T細胞總體數量減少，包括輔助T細胞和細胞毒性T細胞。在調查PD-1+CD8+ TILs的激活狀態時，隨著WHO級別的升高，TIL群體中PD-1+CD8+ TILs的比例顯著降低，在rMGMs中也顯著降低。此外，多變量分析中PD-1+CD8+ TILs比例較低與PFS較低相關，認為PD-1是激活而非衰竭的標志。
所以，更高數量的CD3+CD8+FOXP3-TIL和CD3+CD8+FOXP3-TIL中PD-1表達的的比例能夠作為更高存活率的新型生物標志物。這些發現可能有助于選擇可能受益于免疫治療方法的患者，從而可以指導此類干預的最佳時機。
1 實驗方法
在腦組織原位進行精準的量化分析，離不開不同腦區的劃分。因為不同實驗中動物的腦形態存在差異，研究目標所在的腦切片斷面不統一，導致大部分定量仍然需要根據動物腦圖譜的組織學分區，人工進行腦區標注，再分別統計各個腦區中的信息數據。TissueFAXS Cytometry技術結合了機器學習的人工智能方法，與根據參數調節的個性化分析手段，可以針對具有特殊識別標準的不同組織區域，進行自動識別。如果滿足識別的條件，就可以實現自動化對某些腦區的智能圈選，特別適用于大量神經研究中的自動化批量操作，以及排除人為干擾的精準客觀定量需求。
神經外科臨床研究：202例腦膜瘤臨床樣本的多中心研究，全部實驗僅需使用TG系統自動對組織切片中生物標記物進行定量與評估，分析結果更加可靠；尤其適合生物樣本庫等具有豐富臨床樣本的研究工作。
生物標記物Biomarker：四色熒光標記（CD3，CD8，FOXP3和PD-1）。
臨床免疫治療：免疫熒光檢測細胞毒性T細胞和表達PD-1的細胞毒性TIL作為患者預后檢測方法價格相對低廉。
腫瘤：T細胞浸潤及其激活狀態可預測腫瘤存活率或對化學療法和免疫檢查點抑制劑的反應。
2 實驗步驟
實驗利用StrataQuest軟件，對T細胞浸潤區域的免疫熒光標志物進行自動識別和定量分析。依據組織學分類手動定義感興趣區域（ROI），排除相鄰的正常腦區或壞死區域，篩選在腫瘤細胞含量高（≥60％）的區域中進行鑒定和定量。
TissueFAXS Cytometry定量分析技術以類流式散點圖方式呈現識別的細胞，并在散點圖中設GATE圈門篩選出有效細胞核（DAPI通道）及細胞表面marker（Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555 通道）。基于樣本各通道真實的熒光信號表達，嚴格限定細胞核大小、染色強度及背景閾值參數，結合正、反向回溯功能及cut-off線反復查看、校驗細胞識別結果，以確保分析數據的準確性。
以上原理，作者分析了T淋巴細胞表面CD3、CD8抗體的共表達情況、FOXP3在細胞核內的定位情況以及CD3、CD8、PD-1抗體的共表達情況，并進行數據統計，分別計算以上陽性細胞在總的有效細胞及T淋巴細胞中的占比。
3 實驗結果
Figure 1：原發性腦膜瘤中TILs定量分析數據
（A）CD3（紫色），CD8（綠色），FOXP3（黃色）和DAPI（藍色）標記的原發性腦膜瘤樣本免疫熒光圖像。綠色箭頭指向細胞毒性T細胞，白色箭頭指向輔助性T細胞，黃色箭頭指向CD4+調節性T細胞。
（B,C）CD3+TILs在WHOI-III型的原發性腦膜瘤定量分析。TILs的細分項效應性T細胞(D，E)和調節性T細胞（F）。
Figure 2：復發性腦膜瘤中TILs定量分析數據
（A，B）不同WHO分級的復發性腦膜瘤CD3+ TILs定量分析。TILs的細分項效應性T細胞(C，D)和調節性T細胞（E）。（F）原發性腦膜瘤和復發性腦膜瘤中效應性T細胞定量分析數據比較。
Figure 3: 原發性腦膜瘤中浸潤PD-1-陽性 T細胞比例
（A）CD3（紫色），CD8（綠色），FOXP3（黃色）和DAPI（藍色）標記的原發性腦膜瘤樣本免疫熒光圖像。綠色箭頭指向PD-1+細胞毒性T細胞，白色箭頭指向PD-1-細胞毒性T細胞。（B，C）原發性腦膜瘤中不同WHO分級的CD3+PD-1+TILs比例定量分析。（D）不同WHO分級的原發性腦膜瘤中PD-1+輔助性T細胞的比例（D）和PD-1+細胞毒性T細胞（E）的比例。
Suppl. Figure S2
以類流式散點圖方式呈現識別的細胞，并在散點圖中設GATE圈門篩選出有效細胞核（DAPI通道）及細胞表面marker（Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555 通道）。