2025年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)再次將目光投向了免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域，獲獎(jiǎng)成果揭示了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells, Treg）在自身免疫及炎癥調(diào)控中的核心機(jī)制，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的“剎車器”，再次受到科學(xué)界的重視。
Treg療法臨床管線
從臨床轉(zhuǎn)化來看，Treg在自身免疫、腫瘤免疫以及器官移植等方向進(jìn)展較多。比如在自身免疫病治療方面：針對Treg功能缺陷，通過IL-2信號通路激活或細(xì)胞移植恢復(fù)其活性，已在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病臨床試驗(yàn)中顯示療效，在炎性驅(qū)動小兒自閉癥疾病模型治療等方面取得新進(jìn)展。在癌癥免疫療法革新方面：腫瘤微環(huán)境中過度積累的Treg會抑制抗腫瘤免疫，通過CCR8單抗等藥物靶向清除這類細(xì)胞可增強(qiáng)PD-1抑制劑療效，相關(guān)聯(lián)合療法響應(yīng)率及患者生存期獲得提升。在器官移植排斥防護(hù)方面：輸注體外擴(kuò)增的Treg可降低腎移植等排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。但是，人源Treg療法目前尚未獲得正式批準(zhǔn)成為上市藥物，還需要基礎(chǔ)理論及臨床醫(yī)藥實(shí)踐的多方面突破[1]。
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體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞關(guān)鍵因子
體外產(chǎn)生的Treg細(xì)胞被稱為誘導(dǎo)性Treg細(xì)胞（iTreg），體內(nèi)天然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞被稱為天然Treg細(xì)胞（nTreg)。
IL-2
通過結(jié)合CD4+T細(xì)胞表面受體IL-2R從而激活下游STAT5信號通路，STAT5激活后，促進(jìn)Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄，IL-2信號可以提高Foxp3表達(dá)的穩(wěn)定性和量，防止其被下調(diào)或沉默，同時(shí)維持已分化Treg的抑制功能。
TGF-β1
Foxp3表達(dá)的關(guān)鍵啟動因子也是誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)的直接信號因子。體外誘導(dǎo)iTreg中在TGF-β和IL-2刺激下，初始T細(xì)胞即可產(chǎn)生Foxp3+Treg。
體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程[2]
PBMC分離
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1 將抗凝全血與等體積PBS輕輕混勻，以便降低血液粘稠度。 -
2 在50mL離心管中加入密度離心介質(zhì)（如Ficoll）溶液（體積建議為稀釋血的1/2-1/3）。 -
3 傾斜離心管，緩慢地將稀釋血液覆蓋在密度離心介質(zhì)上。 -
4 室溫條件下，1150×g離心20 min。
注意：操作時(shí)應(yīng)關(guān)閉離心剎車功能，將啟動速度和停止速度降到最低
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5 取出位于密度離心介質(zhì)與血漿層之間的含有PBMCs的白色環(huán),將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50 mL離心管中。
注意：盡量減少吸取血漿和密度離心介質(zhì)，不要觸碰紅色的紅細(xì)胞沉淀。
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6 用PBS補(bǔ)充至50 mL。在室溫條件下，450×g離心10 min。
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7 去除上清液，加入50mL RPMI培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），并充分重懸。
注意：如果存在細(xì)胞團(tuán)塊，通過40 µm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。
nTreg分離
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1 配制分離緩沖液：在PBS中加入0.5%（w/v）人血清白蛋白和2 mM EDTA。
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2 重懸并計(jì)數(shù)PBMCs，在室溫條件下，450×g離心10 min。
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3 每1×107個(gè)PBMCs加入90 µL分離緩沖液和2 µL CD25磁珠，充分重懸混勻后在4℃孵育15 min。
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4 用PBS補(bǔ)充滿至30 mL。在4℃以450×g離心10 min。
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5 準(zhǔn)備LS柱：用3 mL分離緩沖液平衡柱，丟棄流出液。
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6 將細(xì)胞重懸于3 mL分離緩沖液中。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到LS柱上，用新的15 mL離心管收集流出液。
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7 用3 mL分離緩沖液洗柱2次，將收集的流出液儲存在4℃以備后續(xù)步驟使用。
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8 從磁鐵上取下柱。每柱用3 mL分離緩沖液洗脫2次，收集至15 mL離心管中，得到CD25+的nTreg。
注意：如需要可過第二個(gè)柱，可進(jìn)一步提高純度。
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9 在4℃以450×g離心10 min，丟棄上清。
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10 用15 mL的T細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，在4℃以450×g離心10 min，丟棄上清。
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11 將細(xì)胞重懸于0.5 mL的T細(xì)胞培養(yǎng)基（含100 IU/mL的 IL-2）中。轉(zhuǎn)移細(xì)胞至24孔板。再用0.5 mL培養(yǎng)基沖洗離心管，并合并至24孔板。
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12 計(jì)數(shù)nTregs，用T細(xì)胞培養(yǎng)基（含100 IU/mL的IL-2）調(diào)整Treg密度至1-2×106 cells/mL。
注意：通常每個(gè)白細(xì)胞層的產(chǎn)率為1-4 x 106個(gè)Tregs。
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13 在37℃、5%CO2條件下孵育nTreg直至使用。
CD4+T細(xì)胞分離
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1 將nTreg耗竭的PBMCs合并至50 mL離心管中，用PBS補(bǔ)充滿至50 mL。
注意：nTreg耗竭的PBMCs為【nTreg分離】中步驟8-9收集的流出液，用于進(jìn)行CD4?T細(xì)胞分離。
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2 在室溫下以200×g離心PBMCs 5-10 min，去除上清。用50 mL PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)2次。
注意：PBS洗滌對于去除血小板至關(guān)重要，后續(xù)負(fù)向分離試劑盒無法去除血小板。在此低速離心條件下，血小板會留在上清液中，可在顯微鏡載玻片上監(jiān)測血小板去除情況。
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3 用50 mL PBS重懸PBMCs，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
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4 在4℃以450×g離心PBMCs 10 min，去除上清，每107個(gè)細(xì)胞加入40 µl分離緩沖液，重懸細(xì)胞。
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5 每107個(gè)細(xì)胞加入10 µL初始CD4+T細(xì)胞生物素抗體混合物。混合后，在4℃孵育10 min。
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6 加入40 mL冷PBS洗滌細(xì)胞，在4℃以450×g離心10 min。去除上清，每107個(gè)細(xì)胞加入80 µL分離緩沖液重懸細(xì)胞。
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7 每107個(gè)細(xì)胞加入20 µL抗生物素微磁珠。充分混合，在4℃孵育15 min。
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8 用冷PBS補(bǔ)充滿至50 mL，在4℃以450×g離心10 min。
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9 準(zhǔn)備LS磁柱（用3mL 分離緩沖液進(jìn)行平衡）。為避免磁柱過載，每個(gè)磁柱最多用于 2.5×108個(gè)PBMC。
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10 去除上清，用3 mL分離緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至LS柱。收集流出液（含有初始CD4+T細(xì)胞），置于15 mL離心管中。
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11 用2 mL分離緩沖液沖洗離心管，轉(zhuǎn)移至柱上。
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12 用3 mL分離緩沖液洗柱3次，每次等待柱停止滴液后再加入新的液體。
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13 收集流出液（含初始CD4+T細(xì)胞），在4℃以450×g離心10 min。
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14 去除上清后，用15 mL T細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，在室溫下以450×g離心10 min，去除上清/
注意：分離緩沖液含有EDTA，會螯合鈣離子，從而影響T細(xì)胞激活。在進(jìn)行任何刺激實(shí)驗(yàn)之前，需完全移除分離緩沖液，并用15 mL培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次。
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15 用T細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至2-3×106cells/mL。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)瓶或孔板中于培養(yǎng)箱內(nèi)過夜靜置細(xì)胞。
iTreg細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)
誘導(dǎo)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
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1 準(zhǔn)備并預(yù)熱T細(xì)胞培養(yǎng)基，需補(bǔ)充2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
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2 準(zhǔn)備細(xì)胞因子、激活抗體和化合物的儲備濃度：
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3 在T細(xì)胞培養(yǎng)基中配制4倍濃度的預(yù)混液（每孔50 µL）。
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4 前一天，在96孔U型培養(yǎng)板中，每孔加入65 µl含5 µg/mL抗CD3抗體的PBS溶液。用鋁箔包裹培養(yǎng)板，在4℃過夜孵育。
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5 培養(yǎng)當(dāng)天，移除孔中的抗CD3抗體溶液。每孔加入200 µL PBS，洗滌2次后備用。
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6 往孔中加入50 µL的抗CD28抗體和IL-2預(yù)混液，50 µL 的TGF-β1預(yù)混液，50 µL的ATRA預(yù)混液。
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7 用200 µl PBS填充所有空孔，包括邊緣孔。將培養(yǎng)板在37℃、5%CO2條件下預(yù)熱。
初始CD4+ T細(xì)胞接種培養(yǎng)
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1 將細(xì)胞密度調(diào)整密度至2.2-2.6×106cells/mL。
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2 將細(xì)胞加入準(zhǔn)備好的刺激培養(yǎng)板，每孔50 µL細(xì)胞（110,000-130,000細(xì)胞/孔）。每個(gè)孔的總體積現(xiàn)應(yīng)為200 µL。
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3 將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
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4 從第2至3天起，應(yīng)可見增殖細(xì)胞的小簇，隨著時(shí)間推移，這些小簇會聚集成更大的簇。
iTreg表型分析
qRT-PCR法
提取RNA對Foxp3和一個(gè)管家基因（如RPL13A）進(jìn)行qRT-PCR。同時(shí)檢測其他Treg標(biāo)志基因的表達(dá)，例如“Treg上調(diào)基因”IL2RA、CTLA4、IKZF4，以及“Treg下調(diào)”基因IFNG、SATB1。
流式細(xì)胞術(shù)
通過流式細(xì)胞術(shù)篩選出CD4+CD25+Foxp3+Treg。
Treg細(xì)胞的流式表型[2]
Treg相關(guān)產(chǎn)品推薦
近岸蛋白提供T細(xì)胞體外激活培養(yǎng)以及Treg細(xì)胞分化的所需的抗體、人源和鼠源細(xì)胞因子，包括IL-2、TGF-β1、抗CD3抗體、抗CD28抗體等，并能提供批間穩(wěn)定一致的GMP級產(chǎn)品，支持臨床無縫過渡轉(zhuǎn)化。
國際標(biāo)準(zhǔn)品測活
高批間一致性
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參考文獻(xiàn)
[1]Xuemei Tong ,Bin Li From “Immune Homeostasis” to “Immune Perturbation”- Insights and Perspectives on the 2025 Nobel Prize in Physiology or Medicine[J].中國科學(xué)基金,2025,39(4)