補(bǔ)體過度活化在阿爾茨海默病（AD）和額顳葉癡呆（FTD）等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中介導(dǎo)了小膠質(zhì)介導(dǎo)的突觸消除，但是大腦中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性仍然大多未知。
約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究者們發(fā)現(xiàn)分泌型神經(jīng)元蛋白Nptx2與補(bǔ)體C1q結(jié)合，從而在大腦中調(diào)節(jié)其活性。Nptx2缺乏的小鼠顯示補(bǔ)體活性增加，依賴C1q的小膠質(zhì)突觸吞噬，以及興奮性突觸的喪失。在神經(jīng)炎癥培養(yǎng)模型和老化TauP301S小鼠中，通過腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的神經(jīng)元Nptx2過度表達(dá)足以抑制補(bǔ)體活性并改善小膠質(zhì)介導(dǎo)的突觸喪失。并證明Nptx2調(diào)節(jié)大腦中的補(bǔ)體活性和小膠質(zhì)突觸消除，而Nptx2濃度的減少可能會(huì)加重FTD患者中補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)退行性。研究成果以“The neuronal pentraxin Nptx2 regulates complement activity and restrains microglia-mediated synapse loss in neurodegeneration” 為題，發(fā)表在Science Translational Medicine（IF：17.1）上。
?研究結(jié)果?
1. NPTXs在體外結(jié)合C1q并抑制經(jīng)典補(bǔ)體途徑(CCP)的活性
研究者發(fā)現(xiàn)C1q與外周蛋白pentraxins有高親和性結(jié)合。通過實(shí)驗(yàn)，確定C1q與神經(jīng)元蛋白NPTXs相互作用，并形成復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)證實(shí)C1q能夠與NPTXs的pen-traxin結(jié)構(gòu)域結(jié)合。進(jìn)一步的研究表明，NPTXs可以調(diào)節(jié)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解和細(xì)菌殺傷作用，通過抑制C1q活性來阻止補(bǔ)體的功能。總的來說，這些結(jié)果揭示了NPTXs在調(diào)控補(bǔ)體活性方面的重要作用，可能對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療具有潛在的意義。
2.?Nptx2缺失會(huì)增加CCP活性，并導(dǎo)致體內(nèi)興奮性突觸的丟失
在阿爾茨海默病（AD）中，Nptx2在死后大腦和腦脊液中濃度降低，其濃度與疾病狀態(tài)、認(rèn)知表現(xiàn)和病情進(jìn)展相關(guān)。在精神分裂癥患者的腦脊液中，Nptx2的濃度也降低，Nptx2缺乏的小鼠表現(xiàn)出與精神分裂癥相關(guān)的行為缺陷。
鑒于Nptx2作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的發(fā)現(xiàn)，研究者進(jìn)一步探查了Nptx2KO小鼠大腦中是否存在失調(diào)的補(bǔ)體活性。首先，對(duì)2至3個(gè)月大的Nptx2KO小鼠大腦進(jìn)行了C1q的免疫染色，發(fā)現(xiàn)C1q免疫熒光強(qiáng)度在Nptx2KO小鼠和野生型（WT）小鼠的大腦中相似，這一結(jié)果在C1q酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）中得到了驗(yàn)證。雖然Nptx2KO大腦中下游C4的全長(zhǎng)蛋白濃度也未改變，但激活的C4（C4b）的含量顯著增加，與Nptx2缺乏的大腦中補(bǔ)體活性增加一致。
小膠質(zhì)細(xì)胞是補(bǔ)體介導(dǎo)的突觸修剪的執(zhí)行者。鑒于補(bǔ)體活性的增加，研究者想知道小膠質(zhì)細(xì)胞是否在Nptx2KO大腦中表現(xiàn)出吞噬性表型。通過免疫組化染色和免疫印跡法，發(fā)現(xiàn)Nptx2KO小鼠皮層中的吞噬體小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD68的免疫反應(yīng)性明顯增加，但小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在Nptx2KO大腦皮層中沒有改變。研究者進(jìn)一步證實(shí)Nptx2主要在興奮性神經(jīng)元中表達(dá)，并且在興奮性突觸標(biāo)記物蛋白Vglut1和突觸素附近檢測(cè)到Nptx2的突觸標(biāo)記。因此，推測(cè)Nptx2的喪失可能使突觸更容易受到補(bǔ)體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬。通過共免疫染色觀察興奮性突觸后標(biāo)記物Homer1和突觸前標(biāo)記物Vglut1與小膠質(zhì)細(xì)胞CD68+溶酶體的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在Nptx2KO大腦皮層中，Homer1和Vglut1免疫反應(yīng)性在CD68+溶酶體內(nèi)明顯增加，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮性突觸的吞噬在Nptx2KO大腦中增加。
這些結(jié)果表明，補(bǔ)體介導(dǎo)的修剪導(dǎo)致Nptx2KO皮層中的興奮性突觸喪失，而抑制性突觸在Nptx2缺乏的條件下基本不受影響。?
3. 補(bǔ)體抑制可以挽救Nptx2KO大腦中的突觸損失
為了測(cè)試Nptx2KO大腦中的突觸喪失是否依賴于補(bǔ)體系統(tǒng)，研究人員比較了缺乏C1q、Nptx2或兩者的小鼠（Nptx2KO；C1qKO雙缺失小鼠）。研究發(fā)現(xiàn)，在Nptx2KO大腦中，小膠質(zhì)細(xì)胞CD68+溶酶體體積增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞活性增強(qiáng)。然而，在缺乏C1q的情況下，CD68+溶酶體體積并未增加，這表明這種小膠質(zhì)細(xì)胞現(xiàn)象與C1q有關(guān)。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Nptx2KO大腦中，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮性突觸的吞噬顯著增加，而缺乏C1q時(shí)，這種增加的吞噬現(xiàn)象得到減輕。這暗示了C1q在Nptx2KO大腦中調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮性突觸的吞噬過程。
為了驗(yàn)證這一現(xiàn)象，研究人員還注射了能有效抑制C1q活性的抗體到Nptx2KO小鼠的大腦中。結(jié)果顯示，C1q阻斷抗體的注射導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮性突觸的吞噬減少，并且突觸密度得到恢復(fù)。這表明補(bǔ)體系統(tǒng)在Nptx2缺失導(dǎo)致的突觸喪失過程中起著重要作用。
最后，研究人員使用C1q阻斷抗體直接注射到大腦中，進(jìn)一步證明了C1q在突觸喪失過程中的作用。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，抑制C1q活性可減少小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)興奮性突觸的吞噬，并恢復(fù)突觸密度。
4. 在神經(jīng)炎癥神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，神經(jīng)元Nptx2過表達(dá)限制了補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性
為了進(jìn)一步驗(yàn)證Nptx2是否可以改善神經(jīng)毒性，研究人員在將小膠質(zhì)細(xì)胞加入神經(jīng)元培養(yǎng)之前，使用攜帶V5標(biāo)簽的Nptx2或GFP的AAV病毒對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)進(jìn)行感染，讓神經(jīng)元過表達(dá)Nptx2。結(jié)果顯示，與過表達(dá)GFP的對(duì)照組相比，過表達(dá)Nptx2的神經(jīng)元可以預(yù)防由LPS活化小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的神經(jīng)元喪失。研究人員推測(cè)，分泌的Nptx2能夠結(jié)合并阻止細(xì)胞外的C1q，從而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，建立了一個(gè)稱為近距離連接測(cè)定（PLA）的實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)果顯示，通過AAV介導(dǎo)的Nptx2過表達(dá)或添加rNptx2，顯著增加了共培養(yǎng)培養(yǎng)基中C1q-Nptx2復(fù)合物的豐度。
5.?AAV誘導(dǎo)的Nptx2過度表達(dá)可以改善P301S小鼠的突觸損失
為了驗(yàn)證Nptx2是否可以調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)并改善突觸損失，研究團(tuán)隊(duì)注入了過表達(dá)V5標(biāo)記的Nptx2或GFP的AAV病毒到P301S小鼠的海馬中。結(jié)果顯示，Nptx2過表達(dá)后，補(bǔ)體系統(tǒng)中的C4b顯著降低，而總C3和C3b的濃度也有所減少。此外，Nptx2過表達(dá)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞中補(bǔ)體蛋白的活性顯著降低，并減少了突觸的丟失。這進(jìn)一步證明了Nptx2過表達(dá)足以限制補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活并改善突觸損失。
在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)將AAV-Nptx2注射到8.5個(gè)月齡的P301S小鼠的海馬，并在注射后6周通過免疫組織化學(xué)分析了大腦。結(jié)果顯示，Nptx2過表達(dá)不影響Tau蛋白的磷酸化程度和膠質(zhì)細(xì)胞的活化。然而，Nptx2過表達(dá)顯著減少了小膠質(zhì)細(xì)胞中的補(bǔ)體蛋白結(jié)構(gòu)，并降低了興奮性突觸的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬。這與突觸密度的增加相一致，進(jìn)一步證明Nptx2過表達(dá)可以改善補(bǔ)體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞突觸修剪。
6. Nptx2、C1q和Nptx2-C1q復(fù)合濃度在遺傳FTD CSF中發(fā)生變化
補(bǔ)體在神經(jīng)退行性疾病中被認(rèn)為是導(dǎo)致突觸損失和神經(jīng)元損害的主要驅(qū)動(dòng)因素。先前的研究表明，在AD患者的腦脊液中，C3和C4的總量以及通過CCP激活引發(fā)的C3和C4的裂解產(chǎn)物增加。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，癥狀患者的CSF中C1q濃度明顯增加，而Nptx2-C1q復(fù)合物的濃度降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在CSF中存在著Nptx2和C1q的復(fù)合物，且在癥狀患者中的含量較低。此外，CSF中的C3b濃度也增加，支Nptx2作為調(diào)節(jié)CCP活性的潛在因子。
?研究總結(jié)?
這篇文章的主要內(nèi)容是關(guān)于神經(jīng)元蛋Nptx2在調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性和限制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的突觸喪失方面的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病中，補(bǔ)體活性被認(rèn)為是導(dǎo)致突觸丟失和神經(jīng)元損害的主要驅(qū)動(dòng)因素。
在研究中，通過使用細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型，研究者發(fā)現(xiàn)Nptx2能夠與補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合并阻止其激活，從而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)元的損傷作用。此外，研究還表明AAV助力Nptx2的過表達(dá)可以減輕補(bǔ)體引起的突觸喪失，并降低小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的摧毀。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在遺傳性神經(jīng)退行性疾病患者中，Nptx2的濃度降低，而C1q的濃度增加，導(dǎo)致補(bǔ)體活性增強(qiáng)。這一現(xiàn)象可能導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)的失衡，從而加劇神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展。
總的來說，這項(xiàng)研究揭示了Nptx2在調(diào)節(jié)補(bǔ)體活性和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的突觸喪失中的關(guān)鍵作用，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，該研究還強(qiáng)調(diào)了補(bǔ)體系統(tǒng)在神經(jīng)退行性疾病中的重要作用，為深入理解這些疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索
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