上期我們對Cre-loxP系統(tǒng)做了原理和應(yīng)用的基礎(chǔ)介紹，了解了這個系統(tǒng)適用的場景和范圍以及如何獲得轉(zhuǎn)基因動物。以上都是依賴于Cre酶從而實(shí)現(xiàn)基因的敲低和過表達(dá)，要想實(shí)現(xiàn)特定時間的基因的啟動需要更加精準(zhǔn)的誘導(dǎo)型的Cre-lox系統(tǒng)。
更加精準(zhǔn)的誘導(dǎo)型Cre-lox系統(tǒng)
1. CreER重組酶系統(tǒng)
CreER重組酶系統(tǒng)是由Cre重組酶和雌激素受體（estrogen receptor, ER）的激素結(jié)合域相融合組成。在沒有雌激素類似物Tamoxifen的情況下，Cre酶、雌激素受體配體結(jié)合域和熱休克蛋白綁定在一起，存在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)存在Tamoxifen時，熱休克蛋白被排擠掉，Cre酶和雌激素受體的結(jié)合體蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核，Cre酶發(fā)揮作用。
圖1：tamoxifen誘導(dǎo)的Cre-ER系統(tǒng)[1]
2. Cre;Tet系統(tǒng)：
四環(huán)素（Tetracycline,Tet）誘導(dǎo)系統(tǒng)是由E.coli大腸桿菌中Tn10轉(zhuǎn)座子改造而來，可依賴四環(huán)素進(jìn)行可逆地調(diào)控基因表達(dá)。
該系統(tǒng)在大腸桿菌中由四環(huán)素阻遏蛋白（Tet repressor, TetR）和Tet操縱子（Tet operator, TetO）組成：在缺乏四環(huán)素Tc以及其衍生物強(qiáng)力霉素Dox的情況下，TetR二聚體和TetO結(jié)合，阻斷基因表達(dá)；當(dāng)Tc或者Dox與TetR結(jié)合時，誘導(dǎo)TetR構(gòu)象變化，導(dǎo)致其與TetO分離促進(jìn)基因表達(dá)。
圖2：Cre;Tet系統(tǒng)作用原理[2]
該系統(tǒng)有兩種模式：Tet-on和Tet-off。
在Tet-on系統(tǒng)中，TetR被改成rtTA，在Dox存在時，可以和rtTA結(jié)合并激活，激活的rtTA與TRE序列結(jié)合誘導(dǎo)Cre的表達(dá)；在沒有Dox情況下，失活的rtTA無法與負(fù)責(zé)調(diào)控Cre基因的TRE序列結(jié)合，則Cre不表達(dá)。
圖3：Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-on系統(tǒng)[1]
在Tet-off系統(tǒng)中，在沒有Dox情況下，激活的rtTA能夠結(jié)合Cre基因的TRE序列，誘導(dǎo)Cre表達(dá)。在Dox給藥之后，與Dox相互作用的Tta被滅活，不再與TRE結(jié)合，因此Cre表達(dá)受到抑制。
圖4：Dox誘導(dǎo)的Cre;Tet-off系統(tǒng)[1]
基于Cre-loxP系統(tǒng)的工具病毒方案
基于以上的缺點(diǎn)，現(xiàn)如今越來越多的科研工作者選擇新的方式來構(gòu)建條件性基因敲除小鼠，即病毒依賴的Cre-loxP重組系統(tǒng)，以局部注射的方式實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的區(qū)域特異性、更少的花費(fèi)以及更短的實(shí)驗周期。基于Cre-loxP系統(tǒng)的工具病毒方案具體為下圖兩種：
1. 將表達(dá)Cre的病毒注射入轉(zhuǎn)基因獲得Floxed小鼠
可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得條件性基因敲除小鼠Floxed小鼠，再通過構(gòu)建廣譜或者組織特異性的Cre載體病毒，從而實(shí)現(xiàn)全身或者組織特異性的基因敲除。
圖5：給予條件floxed鼠注射Cre依賴表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性過表達(dá)
2.將表達(dá)loxP的病毒注射入轉(zhuǎn)基因獲得Cre小鼠
首先獲得條件Cre的小鼠，再將表達(dá)loxP位點(diǎn)的病毒注射入小鼠體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)或者干擾。常用的Cre依賴表達(dá)系統(tǒng)：DIO序列策略 & LSL序列策略。
如下圖：2019 年慕尼黑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心的研究人員在 Neuron 上發(fā)表研究成果，該研究中作者就基于已有的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá) Cre 的小鼠，構(gòu)建了 Cre 依賴表達(dá)的 AAV-FLEx-Ngn2/Nurr1，注射到小鼠腦內(nèi)后在星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異性的過表達(dá)了 Ngn2 和 Nurr1。圖A中目標(biāo)序列如果換成shRNA序列則可以實(shí)現(xiàn)組織特異性目的基因的干擾。
圖7：給予條件Cre鼠注射Cre依賴表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性過表達(dá)[3]
根據(jù)以上的介紹，我們可以了解到：當(dāng)我們有flox鼠或條件Cre鼠時，通過工具病毒載體就可以快速獲得想要的基因調(diào)控小鼠，小鼠與對應(yīng)的工具病毒總結(jié)如下表，老師們可以根據(jù)自己的需要進(jìn)行工具病毒的選擇：
小編總結(jié)
學(xué)習(xí)完Cre-loxP系統(tǒng)相關(guān)的知識，小編不禁感慨Cre酶和loxP位點(diǎn)的應(yīng)用十分的巧妙。對于基因敲除鼠的培育讓我們可以獲得想要的基因型的老鼠，而在此基礎(chǔ)上工具病毒的使用又極大的縮短了實(shí)驗的時間，吉凱基因提供廣泛的工具病毒，滿足不同課題的設(shè)計需要，能夠進(jìn)一步縮短各位老師們的實(shí)驗周期，感興趣的老師們快來咨詢吧！！!
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【參考文獻(xiàn)】
1.H, K., et al., - Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of. - Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159. doi: 10.5625/lar.2018.34.4.147. Epub 2018, (- 1738-6055 (Print)): p. - 147-159.
2.NP, v.T., et al., - Kupffer cells and not liver sinusoidal endothelial cells prevent lentiviral. - Mol Ther. 2005 Jan;11(1):26-34. doi: 10.1016/j.ymthe.2004.09.012., (- 1525-0016 (Print)): p. - 26-34.
3.N, M., et al., - Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse. - Neuron. 2019 Sep 25;103(6):1086-1095.e5. doi: 10.1016/j.neuron.2019.08.009. Epub, (- 1097-4199 (Electronic)): p. - 1086-1095.e5.