T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病 (T-ALL) 是一種侵襲性血液惡性腫瘤，其中約有75%的病例是由Notch1基因突變導(dǎo)致的，因此Notch1的抑制劑GSI常被用作該病的靶向用藥。然而，臨床上常出現(xiàn)原發(fā)性耐藥或復(fù)發(fā)性耐藥，這大大限制了GSI作為T-ALL靶向用藥的臨床效果。 2021年5月丹麥哥本哈根大學(xué)Jesper V. Olsen團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF:14.919）雜志上發(fā)表題為 《Proteomics of resistance to Notch1 inhibition in acute lymphoblastic leukemia reveals targetable kinase signatures》的研究成果，利用蛋白組和DIA磷酸化修飾蛋白組找到了不同耐藥細(xì)胞共同的特征和新的藥物靶點(diǎn)。 【研究材料】 1. 固有耐藥模型：對(duì)GSI藥物具有固有耐藥的3種細(xì)胞系JURKAT、MOLT-3、PEER，藥物敏感的3種細(xì)胞系DND-41、HBP-ALL、ALL-SIL； 2. 獲得性耐藥模型I：從藥物敏感細(xì)胞系DND-41中篩選獲得性耐藥細(xì)胞株（persister cells）； 3. 獲得性耐藥模型II：從兩例臨床患者中分離到藥物敏感癌細(xì)胞系，利用PDX（patient-derived xenografts）小鼠模型篩選獲得性耐藥細(xì)胞株。 【技術(shù)方法】 蛋白組、DIA磷酸化修飾蛋白組 ?? 步驟1：建立3種GSI耐藥模型，采用蛋白組和DIA磷酸化組分析分子水平變化； ?? 步驟2：分析GSI固有耐藥模型的分子變化特征； ?? 步驟3：分析GSI獲得性耐藥模型的分子變化特征； ?? 步驟4：尋找模型間的耐藥調(diào)控共性，激酶底物分析找到關(guān)鍵激酶PKC，驗(yàn)證其調(diào)控機(jī)制； ?? 步驟5：以PKC為新靶點(diǎn)，探討與Notch1抑制劑聯(lián)合用藥的效果。 1. 建立GSI耐藥模型 為了探索T-ALL癌細(xì)胞對(duì)GSI產(chǎn)生固有耐藥（Intrinsic resistance）和獲得性耐藥（acquired resistance）是否有共同的分子基礎(chǔ)，研究者建立了三種GSI耐藥模型。固有耐藥模型比較了耐藥細(xì)胞系JURKAT、MOLT-3、PEER和藥敏細(xì)胞系DND-41、HBP-ALL、ALL-SIL。獲得性耐藥采用了兩種模型，第一種模型是利用敏感細(xì)胞系DND-41篩選獲得性耐藥細(xì)胞株（persister cells），第二種模型是從兩例臨床患者中分離到藥物敏感癌細(xì)胞系，利用PDX小鼠模型篩選獲得性耐藥細(xì)胞株。研究者利用蛋白組學(xué)和DIA磷酸化修飾蛋白組學(xué)分析了三種模型的分子應(yīng)答異同。 圖1 GSI固有耐藥模型和獲得性耐藥模型的組學(xué)分析流程 2. GSI藥物固有耐藥模型中的分子調(diào)控特征 GSI藥物敏感細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系的蛋白表達(dá)模式存在顯著不同，共發(fā)現(xiàn)596個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中323個(gè)蛋白在耐藥細(xì)胞系中表達(dá)豐度更高。結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫ChEA發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白存在兩個(gè)調(diào)控簇，預(yù)測(cè)其主調(diào)控因子分別是Notch1和Tal1。 GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白功能主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸降解、活性氧清除等過程。將差異蛋白在藥物響應(yīng)數(shù)據(jù)庫CMap比對(duì)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)GSI藥物敏感性應(yīng)答與蛋白合成抑制劑伊米丁和mTOR抑制劑的表達(dá)特征相似性最高。與之相契合的是，在磷酸化修飾組中差異修飾的蛋白功能也顯著富集了mTOR信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白翻譯調(diào)控等途徑。這表明，癌細(xì)胞對(duì)GSI的耐藥性可能通過抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)或蛋白合成來實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。 圖2 GSI耐藥細(xì)胞系在蛋白和磷酸化修飾水平的變化 3. GSI獲得性耐藥模型中的分子調(diào)控特征 比較GSI敏感DND-41親代細(xì)胞（parental cells）及其衍生的耐藥細(xì)胞株（persister cells）蛋白表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，Myb、Brd4、cMyc等主調(diào)控因子在耐藥細(xì)胞株中上調(diào)表達(dá)，其他上調(diào)表達(dá)的蛋白還參與活性氧清除、氧化呼吸、蛋白合成等，這些與固有耐藥細(xì)胞系的情況相似。利用PDX模型篩選的耐藥細(xì)胞系 （PDTALL11、PDTALL19） 也出現(xiàn)了相似的改變。 圖3 獲得性耐藥細(xì)胞系的蛋白和磷酸化修飾差異 4. 激酶-底物富集分析（KSEA）找到關(guān)鍵的耐藥調(diào)控途徑 為了找到共同的調(diào)控方式，研究者利用KSEA算法分析了3種模型下GSI耐藥和敏感細(xì)胞中存在的激酶-底物調(diào)控模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akt1、PKC家族等激酶顯著富集，在耐藥細(xì)胞系中十分活躍。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)三個(gè)耐藥模型中的PKCδ在蛋白水平和磷酸化水平均上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)水平與核糖體S6蛋白磷酸化水平正相關(guān)。用PKCδ的抑制劑處理后，細(xì)胞系中S6磷酸化水平顯著下調(diào)。 圖4 激酶PKCδ在耐藥細(xì)胞系的調(diào)控作用 5. 同時(shí)抑制Notch和PKC降低了耐藥T-ALL細(xì)胞的存活率 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Notch通過cMyc正調(diào)控S6蛋白功能，促進(jìn)細(xì)胞蛋白合成。在藥物敏感細(xì)胞系中，GSI 抑制Notch活性進(jìn)而下調(diào)S6蛋白；而在耐藥細(xì)胞系中，PKCδ活性異常升高，促進(jìn)S6蛋白的磷酸化從而解除了GSI所抑制的蛋白合成，形成細(xì)胞耐藥性。作者對(duì)耐藥細(xì)胞系中同時(shí)加入Notch的抑制劑GSI和PKCδ的抑制劑sotrastaurin，結(jié)果證實(shí)，聯(lián)合用藥顯著抑制了耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)了耐藥細(xì)胞的凋亡。這說明抑制PKCδ活性可以恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)GSI的敏感性。 小編小結(jié)
實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)介
研究結(jié)果
圖5 Notch和PKC聯(lián)合抑制效果
腫瘤治療已經(jīng)有了長(zhǎng)足進(jìn)步，針對(duì)一些關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因已經(jīng)有了很好的靶向藥物治療，但腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性是目前所面臨巨大挑戰(zhàn)。在腫瘤形成過程中可能存在固有耐藥性，在治療過程中則可能產(chǎn)生獲得性耐藥。本研究比較T-ALL腫瘤在不同條件下產(chǎn)生的對(duì)靶向藥物GSI的耐藥性模型，通過蛋白組學(xué)和DIA磷酸化修飾組學(xué)系統(tǒng)分析，找到了這些模型共通的耐藥分子響應(yīng)特征，利用激酶-底物富集分析發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵激酶PKCδ及其調(diào)控靶點(diǎn)S6核糖體蛋白，解析了耐藥機(jī)制，最終發(fā)現(xiàn)了新的腫瘤治療靶點(diǎn)和更有效的聯(lián)合療法，為克服T-ALL治療中GSI耐藥性提供了可能。
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Nat Commun（IF:14.919） | 雙管齊下，讓癌細(xì)胞插翅難逃！DIA磷酸化助力發(fā)現(xiàn)T-ALL白血病新藥靶
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