胃癌(GC)是一種特點為腫瘤細胞和腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)高度異質性的主要腫瘤類型。
胃印戒細胞癌（GSRCC）是胃癌的一種相對少見的病理亞型，占所有胃癌的10%以下，惡性程度極高、預后差。研究表明，早期GSRCC患者的5年生存率高于非GSRCC患者。由于缺乏特殊的臨床表現(xiàn)，超過90%的GSRCC患者診斷時就為晚期；因此，準確和早期的疾病分期對GSRCC患者的治療計劃和預后至關重要。
2023年3月13日，浙江大學陳健，汪洌及德克薩斯大學MD安德森癌癥中心Liang Han共同通訊在Gastroenterology（IF=34）在線發(fā)表題為“Single-cell Profiling of Tumor
Immune Microenvironment Reveals Immune Irresponsiveness in Gastric Signet-ring
Cell Carcinoma”的研究論文。
研究提供了晚期GC患者免疫細胞組成和細胞狀態(tài)的全面分子畫像，強調了GSRCC的適應性免疫無反應性和CXCL13在腫瘤免疫微環(huán)境上的中介作用。該文章針對單細胞轉錄組和蛋白質組學分析提供了一種強大的腫瘤免疫微環(huán)境導向的轉化研究方法。
我們招募了32例不同亞型的晚期GC患者，并使用免疫靶向單細胞圖譜分析了他們的腫瘤免疫微環(huán)境，包括(I)免疫靶向單細胞RNA測序(scRNA-seq，n=20名患者)和(Ii) 通過靶向抗體組合進行蛋白表達分析。
研究發(fā)現(xiàn)，與非GSRCC相比，GSRCC的腫瘤免疫微環(huán)境似乎處于靜止狀態(tài)，CD4+和CD8+T細胞都難以動員，這進一步損害了B細胞的正常功能。CXCL13主要由Tfh、Th17和耗竭的CD8+T細胞產生，是這種轉化的中心協(xié)調者。該研究表明CXCL13的表達可以預測GC患者對免疫檢查點阻斷的反應，這可能與其對三級淋巴結構（TLS）的影響有關。
本文研究強調了產生CXCL13的耗盡的CD8+T細胞在促進抗腫瘤反應中的重要性。對于非GSRCC患者，采取常規(guī)治療包括化療和免疫關卡阻斷可能是可行的；而對于GSRCC患者，提高耗盡的CD8+T細胞產生CXCL13的能力可能是扭轉難治性疾病的關鍵。
實驗部分
為了獲取更為全面的免疫細胞亞群及其細胞狀態(tài)的信息，研究者通過TissueFAXS Cytometry技術，從一張組織切片樣本的全景尺寸上，使用高倍物鏡同時獲取到了9種蛋白標記的成像結果。這種單細胞尺度上的光學原始數(shù)據(jù)，結合連續(xù)全光譜成像及光譜拆分技術，保證每個標記物信號的純凈和準確，為后續(xù)分析提供了可靠的基礎。
TLS為細胞通信以及啟動和維持T和B細胞反應提供了局部和關鍵的微環(huán)境，導致了放大的抗腫瘤免疫反應和有利的結果。CXCL13被認為是TLS的典型標記物，并參與了整個TLS組織。TLS的存在被認為是CXCL13+CD4+和CXCL13+CD8+T細胞獲得臨床益處所不可或缺的。因此，CXCL13可能通過干擾GSRCC中TLS的形成而誘導時間異質性。為了驗證這一假設，我們分析了另一組GC患者的HE染色切片，確實觀察到GSRCC中TLS的頻率低于非GSRCC組織中的TLS(Fig
2 G )。
然后，對腫瘤組織切片進行多重免疫組織化學(MIHC)染色，以揭示CXCL13的空間關系。
實驗采用了mIHC方法，最多可有9個特異標記，并對具有代表性的GSRCC和非GSRCC樣本進行了核染色。事實上，我們在GSRCC中幾乎看不到TLS，但在非GSRCC中普遍存在組織良好的TLS(Fig 1 G，H)。在TLS內發(fā)現(xiàn)大量的CXCL13+CD4+和CXCL13+CD8+T細胞。由于PD-1的表達普遍較低，在CD8+T細胞上可檢測到PD-1和CXCL13的共表達，表明CD8-Tex細胞表達CXCL13的能力較弱。
Fig 1 多重免疫組織化學(MIHC)采用酪胺信號放大(TSA)為基礎的檢測方法和多光譜成像。(G)GSRCC和(H)非GSRCC具有代表性的GC切片分別用E-鈣粘蛋白(青色)、CD4(綠色)、CD19(黃色)、CD8(橙色)、Madcam(紅色)、DC-LAMP(洋紅色)、PD-1(白色)、Epcam(橄欖)、CXCL13(栗色)和細胞核(藍色)染色。
Fig 2 GSRCC和非GSRCC之間蛋白表達的差異
G：非GSRCC和GSRCC HE樣本中TLS頻率。
H：多重免疫組織化學(mIHC)采用酪胺信號放大(TSA)為基礎的檢測方法和多光譜成像。GSRCC(左)和非GSRCC(中)具有代表性的GC切片分別用CD8(洋紅)、CXCL13(橙色)、CD19(綠色)和細胞核(藍色)染色。及T細胞-B細胞聚集的程度(右)。
Tissue
Cytometry技術在胃癌研究中的優(yōu)勢：
1 對胃癌組織切片進行自動全景成像和無痕拼接，獲得高清晰度和高分辨率的數(shù)字化圖像，方便觀察和存儲。
2對胃癌組織中的單個細胞（包括細胞質、細胞核、細胞膜等）進行鑒定和定量分析，利用多種標記物（如蛋白、核酸等）和多種參數(shù)（如染色強度、形態(tài)學、空間分布等）挖掘樣本差異性。
3 對胃癌組織中的腫瘤微環(huán)境進行研究，包括腫瘤標志物檢測、腫瘤轉移、腫瘤干細胞、腫瘤免疫等方面，揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、變化和轉歸機制。
4 利用類流式數(shù)據(jù)呈現(xiàn)和分析技術，通過散點圖、直方圖和熱力圖等方式展示細胞量化結果，通過設門圈選和正反向回溯功能進行細胞群分類或再分析，實現(xiàn)影像與分析結果的緊密結合。
5 根據(jù)樣本和分析需求進行定制化APP制作，實現(xiàn)樣本全自動分析和數(shù)據(jù)輸出，提高工作效率和準確性，同時支持多種硬件升級方案，滿足不同的研究需求。
這些優(yōu)勢使得全景組織細胞定量分析系統(tǒng)成為胃癌研究中的一種強有力的工具，為胃癌的診斷、治療和預防提供了有價值的數(shù)據(jù)支持。