—— iTRAQ+MRM解析氧化銅納米材料導(dǎo)致細菌脫氮能力衰退的關(guān)鍵分子機制
文獻來源：客戶發(fā)表
文章摘要：氧化銅等納米材料在各領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用，其對人體、藻類等生物的毒性影響也逐漸受到關(guān)注，但氧化銅納米材料對細菌脫氮能力的影響鮮有研究。
Paracoccus denitrificans是一種公認的研究細菌脫氮的模式脫氮菌，廣泛分布于水源、土壤、沉積物中，具有將**鹽、亞**鹽、氮氧化物等轉(zhuǎn)化為氮氣的能力。
本文的研究發(fā)現(xiàn)氧化銅納米顆粒（CuO NPs）能夠顯著影響Paracoccus denitrificans細胞中多個關(guān)鍵蛋白的表達，嚴重抑制細菌的脫氮能力。當(dāng)CuO NPs的濃度從0.05 提高至0.25 mg/L時，細菌脫氮效率從98.3% 相應(yīng)降低至62.1%。
細胞形態(tài)和完整性研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒能夠進入細胞內(nèi)部。
蛋白質(zhì)組學(xué)研究進一步揭示CuO NPs能夠調(diào)控氮代謝、電子轉(zhuǎn)運和底物轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白表達，有效揭示了CuO NPs對細菌脫氮的負調(diào)控作用和機制。
實驗過程與結(jié)果：
脫氮細菌依賴于碳源和**鹽分別作為電子供體和受體，以便在厭氧環(huán)境中完成脫氮過程。在對照組中**鹽被迅速消耗，最終清除率為98.4%。在0.05 mg/L CuO NPs存在的條件下，細菌的脫氮效率是99.1%，與對照組并沒有顯著差異。然而，隨著CuO NPs的濃度從0.1上升至0.25mg/L時，**鹽的清除效率分別下降至87.7%和65.6%。
Figure 1. Effects of CuO NPs on the variations of NO3?-N (solid, A), NO2?-N (hollow, A) and N2O-N (B) during 24 h exposure tests. Error bars represent standard deviations of triplicate measurements.
通常來說，氧化金屬納米顆粒的毒性作用可能與金屬離子或納米顆粒的釋放有關(guān)。EDS電鏡掃描結(jié)果顯示CuO NPs 能夠被吸附于細胞表面，并存在于細胞內(nèi)部。CuO NPs 能夠?qū)е录毎麅?nèi)LDH釋放，說明CuO NPs能夠破壞細胞膜的完整性。
Figure 2. Effect of CuO NPs on cellular structure of P. denitrificans. SEM image of bacteria (A), SEM image and EDS analysis of bacteria exposed to 0.25 mg/L CuO NPs (B), LDH release of bacteria exposed to different CuO NPs dose (C), TEM image of bacterial cell without CuO NPs exposure (D), and TEM image and EDS analysis of cells exposed to 0.25 mg/L CuO NPs (E).
作者進一步利用iTRAQ技術(shù)分析了CuO NPs的存在所引起的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的改變。蛋白質(zhì)組分析共鑒定到1499個蛋白質(zhì)，其中有138個蛋白在0.25 mg/L CuO NPs處理24小時后發(fā)生明顯的表達改變。作者利用GO、KEGG和蛋白質(zhì)互作工具對差異蛋白進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CuO NPs調(diào)控的蛋白主要參與氮代謝、電子轉(zhuǎn)運和底物轉(zhuǎn)運相關(guān)等生物過程。
Figure 3. The interaction network of differential proteins induced by CuO NPs. The network was created by the STRING algorithm, and strong interactions are represented by thicker lines.
為了驗證蛋白質(zhì)組結(jié)果，作者采用多反應(yīng)監(jiān)視的方法（MRM）對細胞內(nèi)的GtsB蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)CuO NPs的表達水平下降到了對照組的80%。進一步分析表明CuO NPs顯著降低了葡萄糖的利用以及NADH的水平。
結(jié)論：
通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)的篩選和MRM技術(shù)的后續(xù)驗證，該研究發(fā)現(xiàn)GuO NPs能夠破壞P. denitrificans的細胞膜，并進入細胞內(nèi)，進而引起細胞關(guān)鍵代謝和功能的改變，如電子轉(zhuǎn)運、催化活性等。GuO NPs通過減少葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，進而引起電子供體NADH不足；CuO NPs能夠顯著抑制離子轉(zhuǎn)運鏈中的關(guān)鍵蛋白表達和相關(guān)酶的活性。通過對以上生物行為的影響，CuO NPs能夠顯著引起P. denitrificans的脫氮能力退化。