胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是致死率最高的實(shí)體瘤之一。超過 80% 的 PDAC 患者在接受手術(shù)切除后仍會(huì)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。免疫檢查點(diǎn)阻斷劑改變了包括黑色素瘤和肺癌在內(nèi)的實(shí)體瘤晚期患者的前景，但只有一小部分 PDAC 患者可能從中受益。PDAC 在免疫學(xué)上表現(xiàn)出 "冷"腫瘤微環(huán)境（TME），其特點(diǎn)是促進(jìn)腫瘤的免疫細(xì)胞（如髓源抑制細(xì)胞（MDSCs））的浸潤(rùn)，而且通常缺乏 CD8+T 細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性效應(yīng)功能喪失。近日，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院虞先濬/施思教授團(tuán)隊(duì)在Gut上發(fā)表了名為《CRIP1 fosters MDSC trafficking and resets tumour microenvironment via facilitating NF-κB/p65 nuclear translocation in pancreatic ductal adenocarcinoma》的文章，利用質(zhì)譜流式（CyTOF?），組織成像質(zhì)譜流式（IMC?）等多種不同的技術(shù)，研究了PDAC腫瘤細(xì)胞在腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）形成中的機(jī)制，并根據(jù)基因型異質(zhì)性為PDAC患者提供潛在的聯(lián)合治療策略。
為了探索 PDAC 的微環(huán)境及其形成機(jī)制，研究者利用 Standard BioTools商品化的17 個(gè)marker的腫瘤免疫panel，對(duì) 40 例 PDAC 患者的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了多參數(shù) IMC? 分析（圖 1A），檢測(cè)了腫瘤中的主要的細(xì)胞類型，包括 E-cadherin+上皮細(xì)胞和 αSMA+成纖維細(xì)胞，以及增殖標(biāo)志物 Ki-67，并檢測(cè)到三個(gè)免疫細(xì)胞亞群：CD3+T細(xì)胞、CD68+髓系細(xì)胞和CD20+B細(xì)胞。在 T 細(xì)胞中進(jìn)一步識(shí)別出 CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和 Tregs。由于IMC?具有亞細(xì)胞級(jí)別的分辨率，能夠在空間水平對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分析，因此研究者進(jìn)一步對(duì)掃描圖像進(jìn)行單細(xì)胞劃界，并使用 FlowSOM 鑒定出 20 個(gè)細(xì)胞元群，根據(jù)細(xì)胞類型特異性標(biāo)志物的不同表達(dá)水平，這 20 個(gè)細(xì)胞元群被手動(dòng)合并為7 個(gè)細(xì)胞群，包括 3 個(gè)癌細(xì)胞群、6 個(gè)成纖維細(xì)胞群和 8 個(gè)免疫細(xì)胞群。鄰域分析表明，這些細(xì)胞群之間存在大量的相互作用或回避關(guān)系，這進(jìn)一步表明了 PDAC 微環(huán)境中存在著復(fù)雜的細(xì)胞交流。由此可以看出，利用IMC?技術(shù)不僅可以對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中復(fù)雜的細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，還能夠在空間水平解析細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。由于 CD8+T 細(xì)胞反映了免疫微環(huán)境的激活情況，作者根據(jù) CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)情況將樣本分為兩組然后對(duì)這兩組樣本的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行 RNA 測(cè)序分析，對(duì)比TCGA的正常組織，發(fā)現(xiàn)了差異化的兩個(gè)基因， 并選擇了CRIP1 作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。
圖1.CRIP1 是一種與與 PDAC 的低免疫激活有關(guān)的關(guān)鍵促癌蛋白。(A）獲取和分析 40 例 PDAC 標(biāo)本數(shù)據(jù)的示意圖。(B) 使用所述標(biāo)志物的抗體進(jìn)行染色的代表性圖像。(C）E-cadherin 用于區(qū)分上皮細(xì)胞，αSMA 用于區(qū)分成纖維細(xì)胞，Ki-67 用于區(qū)分增殖細(xì)胞。(D) CD3、CD4 和 CD8 用于表示 T 細(xì)胞，CD68 用于表示髓系細(xì)胞，CD20 用于表示 B 細(xì)胞。(E）通過手動(dòng)合并 FlowSOM 生成的 20 個(gè)元群得到的 7 個(gè)細(xì)胞群中 15 個(gè)標(biāo)志物強(qiáng)度中位數(shù)的熱圖。(F）t-SNE 圖中人工合并得到的 7 個(gè)細(xì)胞群；t-SNE 圖中 PDAC 樣本細(xì)胞中 CD8 的表達(dá)。
由于組織成像質(zhì)譜流式系統(tǒng)具有一機(jī)雙模的特點(diǎn)，不僅能夠檢測(cè)切片樣本，還能夠?qū)δ[瘤樣本的單細(xì)胞懸液進(jìn)行質(zhì)譜流式（CyTOF?）分析。為了進(jìn)一步探索 CRIP1 在免疫抑制中的作用，研究者為T細(xì)胞和非T細(xì)胞分別設(shè)計(jì)了15 個(gè)和 17 個(gè)marker的panel，利用CyTOF?技術(shù)檢測(cè)了20 例患者的新鮮 PDAC 樣本。作者首先對(duì) T 細(xì)胞中的標(biāo)志物表達(dá)水平進(jìn)行了分析，使用 FlowSOM 鑒定出 20 個(gè)細(xì)胞元群，最終合并得到了 5 個(gè)細(xì)胞群。之后作者用t-SNE對(duì)這些細(xì)胞元群、細(xì)胞群和代表性標(biāo)志物的分布進(jìn)行了可視化（圖2 B-E）。結(jié)果顯示，CRIP1 高表達(dá)組別的 CD8+T 細(xì)胞和 CD4+T 細(xì)胞浸潤(rùn)減少，衰竭標(biāo)志物 CD279 的表達(dá)增加。CD279 表達(dá)的增加同時(shí)出現(xiàn)在 CD4+T 細(xì)胞和 CD8+T 細(xì)胞中，這表明 PDAC 中存在廣泛的 T 細(xì)胞衰竭。在 CRIP1 高表達(dá)的樣本中，一些 CD4+T 細(xì)胞的 CD25 表達(dá)較高，可能是 Tregs。同時(shí)，CD45+CD3-細(xì)胞群在 CRIP1 高表達(dá)的腫瘤中明顯富集，這表明不同類型的腫瘤在非 T 細(xì)胞富集方面存在很大差異。
接下來作者通過 t-SNE 和FlowSOM分析非 T 細(xì)胞，鑒定出了 20 個(gè)細(xì)胞群，并將總細(xì)胞群分為 8 個(gè)亞群，發(fā)現(xiàn) MDSCs 在 CRIP1 高分組中明顯富集。另外，作者發(fā)現(xiàn)， CRIP1 的表達(dá)與 PDAC 中 CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與PDAC中MDSC 的浸潤(rùn)呈強(qiáng)正相關(guān)，而在其他腫瘤中則不然。基于這些結(jié)果，CRIP1 在 PDAC 中誘導(dǎo)高 MDSC 浸潤(rùn)和低 T 細(xì)胞浸潤(rùn)，在 PDAC 免疫微環(huán)境中的作用可能比在其他腫瘤中更重要。CRIP1 表達(dá)的升高誘導(dǎo)了高水平的髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）浸潤(rùn)，并促進(jìn)了免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成。結(jié)合其他的技術(shù)手段，研究者進(jìn)一步探究了具體的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)CRIP1/NF-κB/CXCL 軸對(duì)于引發(fā) PDAC 的免疫逃避和 TIME 的形成至關(guān)重要。阻斷這一信號(hào)通路可阻止 MDSC 的遷移，從而使 PDAC 對(duì)免疫療法敏感。
圖2. CRIP1 在 PDAC 微環(huán)境中誘導(dǎo)高 MDSC 浸潤(rùn)和低 T 細(xì)胞浸潤(rùn)。(A）CyTOF? 數(shù)據(jù)采集示意圖，包括組織制備、抗體染色、上機(jī)、數(shù)據(jù)的聚類和降維。(B) T細(xì)胞panel中， FlowSOM 生成的 20 個(gè)元群合并得到的 5 個(gè)細(xì)胞群中15 個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)熱圖。(C）T細(xì)胞panel中，F(xiàn)lowSOM 得到的20個(gè)元群的t-SNE結(jié)果圖。(D)T細(xì)胞panel中，通過人工合并得到的五個(gè)細(xì)胞群的 t-SNE 結(jié)果圖。(E）T 細(xì)胞浸潤(rùn)在 CRIP1 高/低組中的 t-SNE 圖。
在這篇文章中，作者利用組織成像質(zhì)譜流式系統(tǒng)分析了PDAC腫瘤組織的原位信息和空間分布，為腫瘤組織中微環(huán)境提供了全面的視角，并且結(jié)合CyTOF?分析技術(shù)對(duì)細(xì)胞的組成和功能進(jìn)行了進(jìn)一步的挖掘，從多角度分析了腫瘤的微環(huán)境，提高了實(shí)驗(yàn)的深度。另外值得一提的是，在本研究工作中，實(shí)驗(yàn)的順利開展以及研究成果的快速發(fā)表，也正是基于質(zhì)譜流式實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，具有完整的解決方案等特點(diǎn)。同時(shí)，更離不開研究者們辛勤的工作，因此也再次對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院虞先濬/施思教授團(tuán)隊(duì)表示衷心的祝賀。
參考文獻(xiàn)：
Liu X, Tang R, Xu J, et al. CRIP1 fosters MDSC trafficking and resets tumour microenvironment via facilitating NF-κB/p65 nuclear translocation in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Gut, 2023.