患者來源的類器官組織（PDOs）是一種個性化的癌癥模型，可模仿母體腫瘤對化療的反應(yīng)，有幾項研究提出將 PDOs 作為藥物反應(yīng)的個性化模型。PDO 可與基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)，以再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境（ TME） 的主要特征，但這如何改變 PDO 表型和藥物反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。此外，PDO 對藥物的敏感性通常是通過總的細(xì)胞存活率來測量的，這種方法無法解析共培養(yǎng)中的細(xì)胞類型特異性，也無法從機(jī)理上深入了解藥物反應(yīng)。
為了克服這些困難，倫敦大學(xué)學(xué)院癌癥研究所的研究者利用Standard BioTools公司的質(zhì)譜流式（CyTOF®）多參數(shù)，低背景，無熒光串色，數(shù)據(jù)質(zhì)量高等技術(shù)優(yōu)勢，于前期研究中開發(fā)了一種多參數(shù)的巰基反應(yīng)類有機(jī)體原位編碼（TOBis）質(zhì)譜流式（CyTOF®）平臺，用于結(jié)直腸癌（CRC）類器官樣本的研究，能夠?qū)崿F(xiàn)對類器官樣本的原位混樣并進(jìn)行質(zhì)譜流式（CyTOF®）檢測，從而克服類器官研究中，組別多，樣本量少，難以對翻譯后修飾（PTM）信號檢測的限制。[1] 而在2023年11月發(fā)表在《Cell》雜志上的《Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses》這篇文章，這個實驗室進(jìn)一步利用前期建立的TOBis質(zhì)譜流式（CyTOF®）平臺深入解析了抗癌藥物如何調(diào)節(jié) CRC PDOs 的PTM信號傳導(dǎo)和細(xì)胞狀態(tài)。[2]
圖1. 用TOBis質(zhì)譜流式（CyTOF®）檢測類器官的細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)的實驗流程。【1】
為了研究腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs） 如何調(diào)控患者特異性藥物反應(yīng)信號，作者建立了一個高通量三維類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由 10 個單獨培養(yǎng)或與 CRC CAFs 共同培養(yǎng)的 CRC PDOs組成。類器官培養(yǎng)物一式三份，分別用5-氟尿嘧啶（5-FU）、SN-38（伊立替康的活性代謝物）、奧沙利鉑和西妥昔單抗（EGFR抑制劑）、LGK974（PORCN 抑制劑）、Berzosertib（VX-970）進(jìn)行處理。樣本隨后進(jìn)行TOBis質(zhì)譜流式（CyTOF®）染色和檢測流程。作者設(shè)計了44個marker的CyTOF® panel，可識別細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)、DNA 損傷和 PTM 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。最終作者從 2,520 個三維培養(yǎng)物中獲得了超過 1,000 萬個 PDO 細(xì)胞和超過 1,500 萬個 CAFs（3,360 個細(xì)胞類型特異性的PDO+CAF單細(xì)胞信號數(shù)據(jù)集）。
圖2. TOBis 質(zhì)譜流式（CyTOF®）進(jìn)行單細(xì)胞 PTM PDO-CAF 藥物篩選的方案和流程
由于涉及到三千多個單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的挑戰(zhàn)，作者還開發(fā)了新的質(zhì)譜流式（CyTOF®）數(shù)據(jù)分析方法Trellis，能夠?qū)⑻幚砼c配對的對照樣本嵌入樹狀結(jié)構(gòu)并進(jìn)行可視化。作者使用配對 Trellis 分析了 3,360 個（1,680 個 PDO、1,680 個 CAF）單細(xì)胞 PTM 圖譜（>2,500 萬個單細(xì)胞），探索了 PDO和 CAF的藥物、患者和微環(huán)境特異性治療反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)PDOs表現(xiàn)出明顯的患者和微環(huán)境特異性藥物反應(yīng)，但CAF信號傳導(dǎo)并未因患者或藥物而聚集，這表明化療主要改變了PDOs而非CAFs的細(xì)胞狀態(tài)、DNA損傷和PTM圖譜。
圖3. Trellis：基于樹狀結(jié)構(gòu)的單細(xì)胞治療效果分析
圖4. 對單細(xì)胞 PDO-CAF 藥物反應(yīng)的 Trellis 分析
(B) PDO 藥物治療特異性反應(yīng)。左側(cè)為配對組相對應(yīng)的對照組，在 PHATE 1 上評估治療效果，在 PHATE 2上評估響應(yīng)機(jī)制。
(C)患者特異性藥物反應(yīng)解釋了不同的化療敏感機(jī)制和化療難治性患者。
(D)CAFs可為患者提供特異性的5-FU、SN-38和奧沙利鉑化療保護(hù)。
同時，作者還利用質(zhì)譜流式（CyTOF®）多參數(shù)檢測的特點，能夠同時對細(xì)胞的凋亡，增殖，DNA損傷等多種細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行分析，替代了傳統(tǒng)藥物篩選中單純以細(xì)胞活死評估藥效的檢測方法，可以檢測到不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的靶向治療效果。分析的結(jié)果顯示化療在幾乎所有 PDO 中都顯示出靶向有絲分裂停滯（83%），但只有一部分患者和治療組合會引發(fā)細(xì)胞凋亡（40%）。這表明靶向藥物反應(yīng)在 CRC PDO 中很常見，但往往不足以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。因此作者進(jìn)一步分析了化療敏感型和化療難治型PDO的特征。發(fā)現(xiàn)與化療敏感性患者相比，即使化療難治性 PDO 也會出現(xiàn)靶向藥物反應(yīng)，通常引起較低的雙鏈斷裂反應(yīng)，不會激活 PARP 或 Caspase-3，這意味著藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制應(yīng)激無法引發(fā)廣泛的 DNA 損傷和細(xì)胞凋亡。化療難治型PDO通常具有高水平的細(xì)胞內(nèi) pSMAD2/3、pSMAD1/5/9、pMKK4、pBAD、pBTK 和 pNF-κB 信號傳導(dǎo)，這些通路與化療難治型細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。總之，TOBis質(zhì)譜流式（CyTOF®）和Trellis分析顯示，靶向藥物活性在CRC PDO中很常見（甚至在化療難治性PDO中），但細(xì)胞毒性是患者特異性的，與細(xì)胞內(nèi)在的PDO細(xì)胞狀態(tài)和PTM信號相關(guān)。
圖5. PDO 藥物反應(yīng)機(jī)制針對特定患者，與細(xì)胞內(nèi)在狀態(tài)和 PTM 信號相一致
(B) 在藥物治療過程中，Trellis分析中細(xì)胞的特異性分布揭示了靶細(xì)胞狀態(tài)的變化。
(E) 細(xì)胞內(nèi)源性 PTM 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點的 TreEMD-PHATE 顯示 PTM 在化療難治性 PDO 中上調(diào)。
為了從功能上探索 CAFs 在患者特異性 CRC PDO 藥物反應(yīng)中的作用，作者對藥物治療后的 PDO 單培養(yǎng)物和 PDO-CAF 共培養(yǎng)物進(jìn)行了并行 Trellis 分析；Trellis 顯示，CAFs 能以患者和藥物特異性的方式提供不同程度的化學(xué)保護(hù)。CAFs 可以快速調(diào)節(jié) PDOs 中的 PTM 信號網(wǎng)絡(luò)，并使以前對化學(xué)藥物敏感的癌細(xì)胞向新的難化療細(xì)胞命運轉(zhuǎn)變。
圖6. CAF對PDO 21 和 PDO 27 中的PTM 信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。CAF 下調(diào)受保護(hù) PDO 中的 MAPK 和 PI3K 通路，上調(diào) SMAD、 NF-κB 和 BAD 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點。
本實驗室同時間發(fā)表在《Cell》雜志上的《An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization》（詳見：《【Cell】-質(zhì)譜流式揭示結(jié)腸干細(xì)胞極化表型》）中表明，結(jié)腸干細(xì)胞存在于一個連續(xù)的可塑性景觀中，從增殖性結(jié)腸干細(xì)胞（proCSCs）到緩慢循環(huán)的復(fù)活結(jié)腸干細(xì)胞（revCSCs）。[3] 結(jié)合前期的數(shù)據(jù)結(jié)果，作者同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間CAF信號傳導(dǎo)能以患者特異性的方式驅(qū)動proCSC向revCSC的細(xì)胞命運轉(zhuǎn)變，從而保護(hù)癌細(xì)胞免受化療。
總之，作者利用Standard BioTools質(zhì)譜流式（CyTOF®）的技術(shù)優(yōu)勢，開發(fā)出TOBis混樣質(zhì)譜流式（CyTOF®）檢測平臺，實現(xiàn)了高參數(shù)的類器官單細(xì)胞 PTM 圖譜分析和基于Trellis分析方法的治療效果分析，揭示了成千上萬個PDO-CAF培養(yǎng)物中患者特異性的藥物反應(yīng)，為研究異質(zhì)性藥物反應(yīng)機(jī)制提供了新的機(jī)會。
參考文獻(xiàn)：
[1]Qin X, Sufi J, Vlckova P, et al. Cell-type-specific signaling networks in heterocellular organoids. Nat Methods. 2020;17(3):335-342. doi:10.1038/s41592-020-0737-8
[2]Ramos Zapatero M, Tong A, Opzoomer JW, et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 2023;186(25):5606-5619.e24. doi:10.1016/j.cell.2023.11.005
[3] Qin X, Cardoso Rodriguez F, Sufi J, Vlckova P, Claus J, Tape CJ. An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization. Cell. 2023;186(25):5554-5568.e18. doi:10.1016/j.cell.2023.11.004