誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）是一種可以產(chǎn)生并提供了一種體外模擬神經(jīng)組織發(fā)育的方法。iPSC特別有趣的分化應(yīng)用是類(lèi)似于在人類(lèi)認(rèn)知和感覺(jué)處理中神經(jīng)元起著核心作用，神經(jīng)元活動(dòng)的缺陷導(dǎo)致了許多疾病，包括癲癇、阿爾茨海默氏癥疾病和精神分裂癥，IPS誘導(dǎo)神經(jīng)元該怎么操作呢？
?一.培養(yǎng)
1. 使用二級(jí)生物安全柜，使用適當(dāng)尺寸的移液管將iPSC在60 mm培養(yǎng)皿中的STEMCult™-XF細(xì)胞培養(yǎng)基（啟達(dá)生物，貨號(hào)：P2501)中培養(yǎng)。如果從冷凍的iPSC凍存管開(kāi)始，至少接種300000個(gè)細(xì)以上。
2. 細(xì)胞達(dá)到15%-25%的融合度，抽吸用過(guò)的培養(yǎng)基以去除未附著的細(xì)胞，并檢查細(xì)胞團(tuán)塊的大小。如果直徑約為100-200µm，則其大小適合開(kāi)始分化。使用5毫升移液管將3毫升在水浴中預(yù)熱的STEMCult-NDM神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基（啟達(dá)生物，貨號(hào)：P1101)加入培養(yǎng)皿里并輕輕放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。如果平板中沒(méi)有滿(mǎn)足100-200um得大小團(tuán)塊，則加入3ml STEMCult™-XF細(xì)胞培養(yǎng)基（啟達(dá)生物，貨號(hào)：P2501)，每天檢查，直到菌落達(dá)到合適的大小后才能開(kāi)始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基需要每天換液直到細(xì)胞達(dá)到完全融合的狀態(tài)，換液的時(shí)候標(biāo)記出任何非神經(jīng)分化的細(xì)胞團(tuán)塊并用200ul的移液槍去除這些不需要的菌落.
3. 當(dāng)誘導(dǎo)的細(xì)胞密度達(dá)到70%以上，將神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的體積增加一倍對(duì)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)至關(guān)重要。此外，在神經(jīng)誘導(dǎo)后的第4天至第7天應(yīng)觀察到最小的細(xì)胞死亡。如果在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4天至第7天，細(xì)胞的顏色變黃，有許多漂浮的細(xì)胞，則表明iPSC的起始密度過(guò)高。在這種情況下，每天更換神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，去除一些菌落，并將每個(gè)孔/板的體積增加一倍。理想情況下，使用這些變量以確保介質(zhì)不會(huì)繼續(xù)變黃。當(dāng)達(dá)到95%以上開(kāi)始傳代操作.
?二.傳代
1. 從每個(gè)待傳代的平板中吸出用過(guò)的STEMCult-NDM神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基。
2. 將不含CaCl2和MgCl2的DPBS輕輕添加到每個(gè)板中兩次，以沖洗細(xì)胞。
3. 向每個(gè)平板中加入1.5 ml預(yù)熱0.02%EDTA胰酶，并在37°C下孵育3-5分鐘，直到大多數(shù)細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面分離。輕輕拍打平板，使細(xì)胞脫落，并加雙倍以上完全培養(yǎng)基中和并輕輕吹打。
4. 用移液管將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15 ml錐形管中。
5. 向每個(gè)板加入1ml DPBS以收集殘余細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到錐形管中。
6. 用5毫升或10毫升的移液管輕輕地上下移取細(xì)胞懸浮液3次，以打碎細(xì)胞團(tuán)塊。
7. 將細(xì)胞以300 x g離心5分鐘。
8. 吸取上清液，并將細(xì)胞重新懸浮在預(yù)熱的STEMCult-NDM神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基中（即，來(lái)自每個(gè)板的所有細(xì)胞為10ml）。
9. 將懸浮在STEMCult-NDM神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基的細(xì)胞平板到10cm培養(yǎng)皿上。
10. 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞2天。在此期間，細(xì)胞在培養(yǎng)基中漂浮時(shí)會(huì)形成聚集。
11. 一旦聚集體達(dá)到約70-200µm的適當(dāng)尺寸，制備一個(gè)涂有5 ml Matrigel®的10 cm組織培養(yǎng)皿至少1小時(shí)。如果形成的聚集體很少，則將細(xì)胞置于60 mm培養(yǎng)皿中。
12. 使用5毫升或10毫升移液管，取下STEMCult-NDM神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基并通過(guò)細(xì)胞濾網(wǎng)收集分化的神經(jīng)細(xì)胞。
13. 反轉(zhuǎn)過(guò)濾器，將10 ml新鮮預(yù)熱的STEMCult-NDM神經(jīng)細(xì)胞分化培養(yǎng)基通過(guò)過(guò)濾器，在過(guò)濾器中結(jié)合細(xì)胞聚集體，將其轉(zhuǎn)移到Procult™ Matrigel基質(zhì)膠(啟達(dá)生物，貨號(hào)：SD0058)涂層的10 cm板上。
14. 在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞聚集體附著在包被的培養(yǎng)皿上并遷移和增殖。
15. 每2-3天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到融合，并準(zhǔn)備好傳代或冷凍保存。在37°C溫度下使用溫?zé)岬腶ccutase細(xì)胞消化液室溫消化5分鐘。
16. 將STEMCult-NDM放置在涂有Matrigel®的組織培養(yǎng)皿上。等待細(xì)胞達(dá)到70%-95%的融合后再開(kāi)始分化。
17. 一旦細(xì)胞達(dá)到所需的融合度，抽吸培養(yǎng)基并用等量的正常神經(jīng)元培養(yǎng)基代替。
18. 每隔2-3天，吸取培養(yǎng)皿中一半的培養(yǎng)基，并更換為新鮮的正常神經(jīng)元培養(yǎng)基。
注意：由于培養(yǎng)基會(huì)因蒸發(fā)而流失，換液的時(shí)候盡量要吸干凈以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)平衡。
這個(gè)培養(yǎng)的階段NPC細(xì)胞的純度將很容易被檢測(cè)到。含有高百分比NPC的細(xì)胞系將迅速極化并形成神經(jīng)元投射（通常在2-5天左右），而含有高百分比非NPC細(xì)胞（星形細(xì)胞、神經(jīng)嵴細(xì)胞等）的細(xì)胞系則不會(huì)。
?三.檢測(cè)
01.顯微鏡肉眼觀察
第5天=細(xì)胞細(xì)胞鋪板形態(tài)：細(xì)胞分裂后形態(tài)
第15天=細(xì)胞具有明顯極化的軸突和樹(shù)突，并具有明顯可檢測(cè)的電生理特性，如動(dòng)作電位
02.免疫熒光染色
1.將細(xì)胞種在涂有多聚賴(lài)氨酸和層粘連蛋白的玻璃蓋玻片讓細(xì)胞爬滿(mǎn)
2.將樣品固定在PBS中稀釋的4%多聚甲醛（PFA）中。在室溫下培養(yǎng)15分鐘。
3.在室溫下用PBS（3 x 15分鐘）洗滌樣品。
4.通過(guò)在室溫下在PBS+0.1%Triton X-100中孵育10分鐘來(lái)滲透樣品。
5.吸取透化緩沖液，用PBS中稀釋的5%BSA代替以封閉樣品。在室溫下培養(yǎng)60分鐘。
6.通過(guò)在封閉5%BSA-PBS中稀釋制備一級(jí)抗體的工作儲(chǔ)備。不同細(xì)胞類(lèi)型的推薦工作稀釋液和抗體見(jiàn)表1。將蓋玻片置于一級(jí)抗體溶液中，并在2-8°C下孵育過(guò)夜
7.在室溫下用PBS（3 x 15分鐘）洗滌樣品。
8.吸取PBS并加入在5%BSA-PBS中稀釋的二次抗體。將蓋玻片在室溫下避光培養(yǎng)一小時(shí)。
9.在室溫下用PBS（3 x 15分鐘）洗滌樣品。
10.如果需要，加入在PBS中稀釋的DAPI，在室溫下孵育5分鐘。
11. 在載玻片中加入一滴Vectashield®。小心地使用針頭和鉗子將蓋玻片從細(xì)胞側(cè)向下轉(zhuǎn)移到玻片上。用指甲油密封，上機(jī)拍照。
03.使用電生理學(xué)評(píng)估神經(jīng)元質(zhì)量
1. 從玻璃毛細(xì)管上拔下移液管。當(dāng)填充內(nèi)部移液管溶液時(shí)，其電阻應(yīng)在3至6 MΩ之間。
2. 將含有分化的人iPSC衍生神經(jīng)元的單個(gè)蓋玻片轉(zhuǎn)移到加熱的記錄室中，用不含苯酚的神經(jīng)元培養(yǎng)基連續(xù)灌注（1 ml/min），用CO2（5%）和O2（95%）的混合物鼓泡，并使用自動(dòng)溫度控制器保持在35°C。
3. 選擇要檢測(cè)的培養(yǎng)孔。
4. 在移液管中注入內(nèi)部移液管溶液，并將其放置在電極支架中。降低移液管，將其放入外部溶液中。補(bǔ)償偏移后，在遠(yuǎn)程微操作器的幫助下，將移液管接近所選的細(xì)胞，以形成高電阻細(xì)胞附著密封。
5. 一旦形成密封并建立了整個(gè)電池配置，需要80%-90%的串聯(lián)電阻。
6. 等待5到10分鐘后再開(kāi)始記錄。細(xì)胞內(nèi)容物與內(nèi)部移液管溶液一定要平衡。
對(duì)于采集，將濾波器設(shè)置為2 kHz，采樣率設(shè)置為20 kHz。?
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