支原體概念和污染的影響
支原體（Mycoplasma）又稱霉形體，是目前發現的最小、最簡單的無細胞壁的原核生物，直徑大小0.1~0.3μm，能通過濾膜且呈高度多形性，是哺乳動物細胞培養中相對常見且難以檢測的污染物。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。
支原體（mycoplasma）是細菌中最小的一種微生物，在生物學分類中屬于柔膜菌門、柔膜菌綱，又分屬于不同目科屬。其中研究較多的支原體目、支原體科，主要包含支原體屬、脲原體屬兩個種屬。
支原體污染對細胞培養造成多方面的不良影響，已經成為在細胞培養時的一個嚴重問題，保守估計常規細胞培養中支原體污染率為15~35%，嚴重干擾實驗結果的可信度。
細胞培養中95%的支原體污染主要是由萊氏無膽甾原體、精氨酸支原體、口腔支原體、發酵支原體、人型支原體、豬鼻支原體引起的。支原體在培養基上，形成的菌落呈“煎雞蛋“形狀。細胞培養上清和細胞膜適宜支原體生長，寄生在細胞表面的支原體可以穿透宿主細胞膜。
支原體污染來源主要有：細胞培養液或其成分（如培養基原料、血清和其他試劑）、實驗室操作人員、細胞培養箱、液氮培養箱、空氣中的粒子和氣溶膠、抗生素的過度使用、密封不當的細胞培養物和污染了支原體的細胞等。
與此同時，這些污染對應的危害為：導致細胞制品或以細胞為介質進行生產的產品在下游純化過程中可能因未能有效去除支原體而造成批次報廢、污染其接觸的所有相關設備設施甚至中間或終產品、導致其他正常細胞受到支原體污染、導致重要細胞或病毒種子庫受到支原體污染而報廢、導致實驗室整體環境受到污染而被迫停止生產或實驗操作進行支原體去除、導致支原體產生耐受性而更難以去除、支原體污染面積擴大、對實驗室中的其他細胞培養物造成威脅。
圖3. 支原體污染的危害
因此，定期進行支原體檢測和去除，確保無支原體存在細胞培養體系內才能保障科學研究工作的正常進行。
支原體檢測方法介紹
在生物制藥和細胞研究中，支原體污染是一個嚴重的問題，因為它可能影響實驗結果和產品質量。因此，支原體檢測對于確保細胞培養物和生物制品的安全性和可靠性至關重要。
目前常用的支原體檢測方法包括培養法、PCR（聚合酶鏈式反應）法、熒光染色法、ELISA（酶聯免疫吸附試驗）法、qPCR（實時定量PCR）、代謝活性測定（eg. ATP酶法）等。各種支原體檢測方法優缺點如下：
|
序號 |
方法類型 |
靈敏度 |
專屬性 |
優點 |
缺點 |
|
1 |
培養法 |
高 |
高 |
1.靈敏度高 |
1.需要建立P2實驗室； |
|
2 |
指示細胞法 |
高 |
低 |
1.藥典(ChP, EP, USP, JP)推薦方法； |
1.需要建立P2實驗室； |
|
3 |
NAT法 （基于核酸擴增技術） |
高 |
取決于引物/探針序列 |
1.藥典推薦的傳統替代方法； |
1.檢測結果可靠性高度依賴于所制備樣本的質量； |
|
4 |
ELISA法 |
中 |
中 |
1.實驗簡單、快速，~5h; |
1.依賴于抗體，存在局限性； |
|
5 |
ATP酶法 |
中 |
高 |
1.實驗簡單、快速； |
1.需要搭配熒光檢測儀器； |
|
6 |
等溫擴增法 |
高 |
中 |
1.實驗簡單、快速 |
1.肉眼觀察結果； |
表1.不同支原體檢測方法對比
合適支原體檢測方法的建立，需要考慮檢測結果僅用于參考還是用于產品相關樣本等的放行，是否符合法規藥典要求、是否做了方法驗證確認了方法的靈敏度、專屬性和耐用性，是否與藥典方法可比等。
若涉及產品放行的支原體檢測，需使用藥典規定方法，即培養法或指示細胞法，或者經驗證與藥典規定可比的NAT法（如qPCR法，一般驗證越早開展越好）。
若不涉及產品放行的支原體檢測，即對于日常檢測用細胞或者研發早期的細胞等，快速檢測支原體的方法作為首選，其中包括巢式PCR法、LAMP等溫擴增法、qPCR法、ATP酶法和ELISA法。
支原體巢式PCR法檢測試劑盒（2G）介紹
基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸擴增技術，翌圣生物開發了一系列支原體快速檢測的試劑盒，包括熒光探針qPCR法支原體檢測試劑盒、一步恒溫顯色法支原體檢測試劑盒和巢式PCR法支原體檢測試劑盒。
其中，支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G)是基于巢式PCR法(NestedPCR)對各種生物材料（如細胞培養物、實驗動物分泌物和動物血清等）支原體感染的檢測。該試劑盒采用定量PCR技術，針對支原體16S-23S rRNA序列保守區域設計兩套引物，進行兩輪PCR擴增，以第二輪擴增產物為準進行支原體污染情況判斷。其可檢出包括口腔支原體(M.orale)、肺炎支原體(M.pneumoniae)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨酸支原體(M.arginini)、雞敗血支原體(M.gallisepticum)、關節液支原體(M.synoviae)、發酵支原體(M.fermentans)、檸檬螺原體(Spiroplasma citri)、唾液支原體(M.salivarium)等在內的共34種支原體，靈敏度可達2.5 copies/μL，對于10 CFU/mL支原體標準菌株也可正常擴增有條帶，具備特異性強、靈敏度高、操作方便快速等特點，可直接用于細胞培養上清液的檢測。
本產品相較于常規PCR法支原體檢測試劑盒，可避免由于引物與模板之間的非特異配對，導致非特異性產物的產生；還可靈敏的檢測到樣本中微量的支原體DNA，避免假陰性的產生。
本產品主要用在日常檢測用細胞或者研發早期的細胞的支原體快速檢測中。
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產品信息
|
產品信息 |
支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G)（貨號40614ES） |
GMyc-PCR支原體檢測試劑盒（貨號40601ES） |
|
檢測支原體種類 |
34種，其中有9種藥典涉及到的支原體 |
12種，其中有3種藥典涉及到的支原體 |
|
檢測限 |
靈敏度可達2.5copies/uL |
靈敏度10copies/uL |
|
適用機型 |
常規PCR儀器 |
常規PCR儀器 |
|
應用 |
定性檢測樣本中支原體DNA |
定性檢測樣本中支原體DNA |
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產品特點
·
檢測種類多：優化的巢式PCR技術可檢測多達34種支原體；
·
專屬性強：針對16S-23S rRNA設計引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣物種交叉反應；
·
靈敏度高：檢測限可低至2.5 copies/μL；
·
操作簡便：樣本制備和檢測總時長可短至2h以內；
·
安全性高：試劑盒內陽性對照(PC)無感染性，完全消除污染風險。
·
//
實驗數據
檢測限
1、本試劑盒第一輪PCR擴增產物靈敏度為1x103 copies/μL：
2、本試劑盒第二輪PCR擴增產物靈敏度為2.5 copies/μL：
專屬性
1、檢測范圍：本2G版本巢式PCR支原體檢測試劑盒檢測了中外藥典要求的10CFU/mL靈敏度的共8種支原體，均可檢出。
PS：藥典要求的支原體滅活菌株DNA模板濃度為10CFU/mL，雞敗血支原體、萊氏無膽甾原體由于樣本不足未檢測
|
序號 |
樣本名稱（英文） |
樣本名稱（中文） |
是否檢出 |
|
1 |
Mycoplasma fermentans |
發酵支原體 |
√ |
|
2 |
Mycoplasma citri |
檸檬螺原體 |
√ |
|
3 |
Mycoplasma hyorhinis |
豬鼻支原體 |
√ |
|
4 |
Mycoplasma pneumoniae |
肺炎支原體 |
√ |
|
5 |
Mycoplasma orale |
口腔支原體 |
√ |
|
6 |
Mycoplasma synoviae |
關節液支原體 |
√ |
|
7 |
Mycoplasma arginini |
精氨酸支原體 |
√ |
|
8 |
Mycoplasma salivarium |
唾液支原體 |
√ |
|
9 |
PC |
陽性對照 |
√ |
|
10 |
NTC |
陰性對照 |
× |
2、樣本基質干擾：選取了14種常見樣品基質和試劑盒中的陽性對照及其加標（2.5copies/μL陽性對照）、陰性對照（PCR Mix）做驗證，14種基質均未檢出支原體。
|
加樣順序 |
樣品名稱 |
加樣順序 |
樣品名稱 |
|
1 |
MEM（1×） |
9 |
RPMI medium |
|
2 |
MCDB 131 |
10 |
L-15 LEIBOVITZ MEDIA |
|
3 |
F-12 |
11 |
NUTRIENT MIXTURE-F-12 HAM'S |
|
4 |
IMDM |
12 |
RPMI Medium Modified |
|
5 |
BME |
13 |
Medium 199/EBSS |
|
6 |
McCoy's 5A medium |
14 |
DMEM/LOW GLUCOSE |
|
7 |
DMEM |
15 |
陽性對照 |
|
8 |
opti-MEM |
16 |
NTC |
產品信息
|
產品 |
貨號 |
品名 |
規格 |
|
支原體巢式PCR (2G) |
40614ESES |
GMyc-PCR Mycoplasma Detection Kit (2G) 支原體PCR檢測試劑盒（巢式PCR）(2G) |
10 assays / 20 assays |
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