x; box-sizing: border-box;">8,820bp
11,600bp | | 0.7 | 410bp | 660bp | 6,400bp | 8,500bp |
| 0.8 | 320bp | 530bp | 4,830bp | 6,500bp |
| 0.9 | 260bp | 440bp | 3,770bp | 5,140bp |
| 1.0 | 220bp | 370bp | 3,030bp | 4,160bp |
| 1.2 | 160bp | 275bp | 2,070bp | 2,890bp |
| 1.5 | 110bp | 190bp | 1,300bp | 1,840bp |
| 2.0 | 65bp | 120bp | 710bp | 1,040bp |
| 3.0 | 30bp | 60bp | 300bp | 460bp |
| 4.0 | 18bp | 40bp | 170bp | 260bp |
| 5.0 | 12bp | 27bp | 105bp | 165bp |
聚丙烯酰胺凝膠中，溴酚藍和二甲苯青FF的表觀分子大小
| 丙烯酰胺：bis(19:1)，凝膠（%） | 溴酚藍 | 二甲苯青FF |
|---|
| 變性凝膠 |
| 4.0 | 50堿基 | 230堿基 |
| 5.0 | 35堿基 | 130堿基 |
| 6.0 | 26堿基 | 105堿基 |
| 8.0 | 19堿基 | 75堿基 |
| 10.0 | 12堿基 | 55堿基 |
| 15.0 | 10堿基 | 40堿基 |
| 20.0 | 8堿基 | 28堿基 |
| 30.0 | 6堿基 | 20堿基 |
| 非變性凝膠 |
| 3.5 | 100 bp | 460 bp |
| 5.0 | 65 bp | 260 bp |
| 8.0 | 45 bp | 160 bp |
| 12.0 | 20 bp | 70 bp |
| 15.0 | 15 bp | 60 bp |
| 20.0 | 12 bp | 45 bp |
Loading Buffer 常見組分舉例：
10 mM Tris-HCl (pH 7.6)
60 mM EDTA
0.03% 溴酚藍
60% 甘油
Loading Buffer 常見組分
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 | 備注 |
|---|
| T105291 | 三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl) | 用于分子生物學和細胞培養,≥99.0%(AT) | 1185-53-1 | 100g,500g | 鹽 |
| X105504 | 二甲苯青FF | 分子生物學級 | 2650-17-1 | 5g,25g | 指示劑 |
| B109645 | 溴酚藍 | Indicator | 115-39-9 | 10g,25g,50g | 指示劑 |
| G118851 | 甘油 | 無菌,for molecular biology | 56-81-5 | 100ml | 密度成分 |
| E118595 | 乙二胺四乙酸二鈉,二水 | 分子生物學和電泳級,99% | 6381-92-6 | 100g,500g | 螯合劑 |
凝膠材質
瓊脂糖和聚丙烯酰胺是核酸電泳中最常用的兩種凝膠基質。兩種材料都能形成三維基質，用于核酸的分離。
凝膠材質的選擇，主要取決于核酸樣品的大小和期望達到的分辨率。瓊脂糖凝膠可用于分離0.05-50kb的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔徑較小，可用于分離小于3kb的核酸分子。 某些情況下，可采用聚丙烯酰胺凝膠以獲得片段小于100bp的單堿基分辨率。
瓊脂糖凝膠和聚丙烯凝膠之間的差異
| | 瓊脂糖 | 聚丙烯酰胺 |
|---|
| 凝膠灌制方法 | 融化和凝固 | 開始化學反應 |
| 核酸回收 | 融化和提取 | 溶解和擴散，或電解 |
| DNA分離范圍 | 50-50,000 bp | 5-3,000 bp |
| 分辨力 | 5-10核苷酸 | 單核苷酸 |
A)瓊脂糖凝膠
瓊脂糖溶液加熱并冷卻后，就會形成凝膠基質，用于核酸電泳。由于瓊脂糖凝膠加熱可逆，因此，通過溶解含有目的片段的凝膠，可提取電泳分離出的核酸。
* 確定瓊脂糖比例
通過改變基質的百分比來調整孔徑大小，從而有效分離不同大小的核酸。瓊脂糖凝膠的含量與分離核酸大小成反比。
推薦百分比瓊脂糖凝膠用于DN**段分離
| 凝膠百分比 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 |
|---|
| 高效分離的范圍(bp) | 2,000-50,000 | 1,000-20,000 | 800-12,000 | 800-10,000 | 600-10,000 | 400-8,000 | 300-7,000 | 200-3,000 | 100-2,000 | 25-1,000 | 10-500 | 10-300 |
凝膠比例計算為:凝膠%(w/v)=(瓊脂糖g/緩沖液ml)x 100%
* 用于核酸電泳的瓊脂糖選型：
生化級瓊脂糖適用于普通核酸電泳；
Wide range瓊脂糖可用于分離堿基數量較低的DNA，約50-1000bp；
低熔點瓊脂糖適用于DNA提取，也是凝膠內酶反應的理想選擇；
低EEO瓊脂糖，純度更高，有助于和加快核酸條帶電泳速度、減少條帶擴散并提高電泳分辨率；
高分辨率瓊脂糖可用于分離堿基數量差異在2%左右的小DN**段（20-800bp）。
瓊脂糖
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 |
|---|
| A104062 | 瓊脂糖 | for biochemistry | 9012-36-6 | 5g,25g,100g,500g |
| A118882 | 瓊脂糖 | Wide range(multipurpose) | 9012-36-6 | 5g,25g,100g |
| A118881 | 瓊脂糖 | High resolution, DNase, RNase, NICKase, none detected | 9012-36-6 | 25g,100g |
| A118880 | 瓊脂糖 | low EEO | 9012-36-6 | 5g,25g,100g,500g |
| A104063 | 低熔點瓊脂糖 | 低熔點,適用于分離小的核酸片段 | 9012-36-6 | 5g,25g |
B)聚丙烯酰胺凝膠
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體聚合而成的聚合物，通常與雙丙烯酰胺或N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺結合使用。 交聯劑雙丙烯酰胺含有兩個單位通過亞甲基橋連的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反應-通常由過硫酸銨(APS)引發。在既定溫度下，APS和/或TEMED的濃度決定了聚合速率。
* 聚丙烯酰胺組分選型
核酸分離，通常采用 3–30% (%T)的聚丙烯酰胺凝膠。
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g/緩沖液ml]x 100%
%C(w/w)=[雙丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+雙丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺常用組分及應用
| 丙烯酰胺:bis | %C | 相對孔隙大小 | 研究應用 |
|---|
| 19:1 | 5% | 小 | DNA和變性凝膠 |
| 29:1 | 3.3% | 中 | 非變性凝膠中ssDNA和RNA |
| 37.5:1 | 2.7% | 大型 | 蛋白凝膠 |
* 確定聚丙烯酰胺比例
在凝膠中，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺(簡稱為“bis”)的總濃度(以%T表示)決定了孔隙大小。%T百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子越小。
不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍表
| 丙烯酰胺（%） | 3.5 | 5.0 | 8.0 | 12.0 | 15.0 | 20.0 |
|---|
| 有效分范圍(bp) | 100~2000 | 80~500 | 60~400 | 40~200 | 25~150 | 10~100 |
* 確定配方（以50ml體系為例：）
| 成分 | 丙烯酰胺：Bis | 10*TBE | TEMED | 10% APS | dd H2O |
|---|
| 濃度 | 目標濃度 | 總體積的1/10 | 0.5μl/ml | 5μl/ml | 補足體積 |
丙烯酰胺：雙丙烯酰胺的組分-可預先制備成原液，方便使用。
丙烯酰胺：雙丙烯酰胺為神經毒素，實驗時應使用防護設施，小心操作。
聚丙烯酰胺凝膠組分
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 |
|---|
| A108470 | 丙烯酰胺 | 電泳專用級 | 79-06-1 | 25g,100g,500g |
| M104026 | N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺 | 電泳級, ≥99.0% (T) | 110-26-9 | 25g,100g,500g |
| T105496 | 四甲基乙二胺(TEMED) | 用于電泳,99% | 110-18-9 | 25ml,100ml |
| A112447 | 過硫酸銨APS | 99.99% metals basis | 7727-54-0 | 25g,100g,500g |
電泳緩沖液
電泳緩沖液和凝膠制備緩沖液應盡量相同，確保有效的導電性。
電泳緩沖液的選擇取決于樣品大小、運行時間和后電泳過程，其中Tris-醋酸鹽EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的兩種緩沖液。
緩沖液選擇指南
| 緩沖液 | 產品優勢 | 缺點 | 核酸分辨率包裝 |
|---|
| | | | DNA | RNA |
| TAE | ?可更好地分離大片段
?緩沖能力低；更適用于短時間運行
?適合于下游的酶學應用 | ?更容易導致過熱 | ＞1,000bp | ＞1500 |
| TBE | ?適用于短片段（線性dsDNA在TBE中遷移慢10%）
?離子強度高、緩沖能力強；適用于長時間運行
?不易導致過熱 | ?抑制酶，不適合下游酶學步驟（如克?。?/td> | ＜5,000bp | ＜1500堿基 |
檢測dsDNA和RNA，一般在變性瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠的條件下進行。在緩沖液中加入變性劑會破壞核酸之間的氫鍵，減少二級結構的生成。常見的變性劑有：瓊脂糖凝膠，磷酸鈉緩沖液中的乙二醛和DMSO、NaOH- EDTA緩沖液、MOPS緩沖液中的甲醛或甲酰胺等；聚丙烯酰胺凝膠，TBE緩沖液中的尿素。
生物緩沖液
常見變性劑
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 |
|---|
| F103362 | 甲酰胺 | 分子生物學級,≥99.5% | 75-12-7 | 100ml,500ml,2.5L |
| G103130 | 乙二醛溶液 | 用于分子生物學,40% in H2O(8.8 M) | 107-22-2 | 25ml,100ml |
| D103277 | 二甲基亞砜 | 分子生物學專用,≥99.9% | 67-68-5 | 250ml |
| U111901 | 尿素 | 電泳級,≥99.5% (T) | 57-13-6 | 500g,1Kg |
染料
核酸樣品染色的兩種常用方法，包括:1)凝膠內染色；2)電泳后染色。
凝膠內與電泳后染色的利弊
| 方法 | 優勢 | 注意事項 |
|---|
| 凝膠內染色 | ?更便利
?工作流程更快
?所需染色更少 | ?在長時間運行后，染色可能會消失
?染色劑只能使用一次
?可能改變樣品遷移性 |
| 電泳后染色 | ?提供更精確的分子大小分析
?允許重復使用染色液或多個凝膠同時染色 | ?工資流程耗時長
?所需染色劑較多
?可能會產生較多有害物質 |
A）凝膠內染色
使用熒光核酸染色劑，是核酸內染色的常用方法?？稍诃傊悄z制備時加入推薦濃度核酸染色劑(常用溴化乙錠0.5 μg/mL)。
熒光核酸染色劑
| 產品號 | 名稱 | 級別 | Cas | 規格 |
|---|
| E119045 | 溴化乙錠(EB) | 分子生物學級,粉末,≥95% (HPLC) | 1239-45-8 | 1g,5g,25g |
B）電泳后染色
電泳后染色常用銀染方法對聚丙烯酰胺凝膠進行染色。
常規步驟如下：
（1）取下凝膠放入染色盒中用蒸餾水沖洗2次；
（2）固定：將膠放于固定液中振蕩，固定10min；
（3）氧化：倒出固定液，水洗后用1%**氧化3min，用蒸餾水漂洗2次，每次2s；
（4）染色：放入銀染液中避光染色30min；
（5）洗滌：蒸餾水漂洗15s；
（6）顯色：放入顯色液中顯色；
（7〕停顯：待有清晰條帶出現（背景不太深時）倒出顯色液，加入10%乙酸終止顯色；
（8）水洗，成像。
固定液、染色液、顯色液成分：
固定液：10%乙醇，0.5%乙酸
銀染液：0.2%**銀，用之前加200ul甲醛（250ml銀染液中）
顯色液：1.5%氫氧化鈉，0.5%甲醛
銀染相關試劑
