? ? ? ? 質(zhì)譜流式技術(shù)實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平檢測(cè)幾十個(gè)通道的同時(shí)檢測(cè)，可以系統(tǒng)全面的分析病理狀態(tài)下各類(lèi)免疫細(xì)胞在表型和功能上的變化，從中發(fā)現(xiàn)一些新的免疫細(xì)胞亞群、揭示新的免疫機(jī)制。近年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室將質(zhì)譜流式用于HIV的相關(guān)的研究，至2020年年初，已經(jīng)有二十余篇文章發(fā)表，主要涉及HIV病毒感染不同階段免疫系統(tǒng)的變化以及ART治療相關(guān)免疫機(jī)制等方面。
01
HIV病毒感染過(guò)程中對(duì)于不同免疫亞群的影響
? ? ? ? CD4+ T 細(xì)胞是HIV 病毒的主要攻擊對(duì)象，也是該領(lǐng)域內(nèi)最受關(guān)注的細(xì)胞種類(lèi)。2017 年，在Cell Rep.報(bào)道的一項(xiàng)研究中，美國(guó) Gladstone 病毒與免疫研究所利用體外實(shí)驗(yàn)研究了HIV 感染對(duì)于CD4+T 細(xì)胞的影響。利用質(zhì)譜流式，研究人員細(xì)致分析了不同感染時(shí)間點(diǎn)CD4+T 細(xì)胞38 個(gè)表面marker 的表達(dá)，對(duì)T 細(xì)胞表型進(jìn)行了精細(xì)的亞群和降維分析。短期融合實(shí)驗(yàn)（2h）表明，HIV 對(duì)CD4+T 的結(jié)合是具有選擇性的，它只結(jié)合包含記憶CD4+ T 細(xì)胞（CD4+ Tm）在內(nèi)的部分細(xì)胞；而長(zhǎng)期感染實(shí)驗(yàn)(4day)則揭示了宿主細(xì)胞與病毒之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系：一方面CD4+T 的表型在此過(guò)程中發(fā)生了顯著的變化(如圖1)；另一方面，在不同T 細(xì)胞亞群中，病毒基因的表達(dá)情況也有顯著不同。例如CD57+和CD127+Tm 都會(huì)感染HIV，但是病毒基因只在前者里面表達(dá)，提示在部分CD4+T 細(xì)胞中對(duì)于HIV 病毒存在“post-entry block”機(jī)制[4]。
注意B 圖中，由于幾個(gè)主要marker 的表達(dá)發(fā)生較大改變，在tsne 圖中，相當(dāng)一部分被感染細(xì)胞（藍(lán)色）已經(jīng)無(wú)法和未感染（紅色）細(xì)胞重合。圖片來(lái)源：[4]
? ? ? ? 2018 年 Manganaro 等人在此方向進(jìn)行了更深入的研究，利用質(zhì)譜流式HIV 感染的T 細(xì)胞進(jìn)行了19 個(gè)通道的同時(shí)檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)IL-15 可以促進(jìn)CD4+ Tm 干細(xì)胞的增殖，顯著改變CD4+ Tm 的組成，在建立具有自我更新能力的HIV 存儲(chǔ)庫(kù)的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，相關(guān)信號(hào)通路的抑制劑則保護(hù)CD4+Tm 免受病毒的感染。[3]
? ? ? ? 除了CD4+Tm 以外，TFH(濾泡輔助T，follicular helper T)也是該領(lǐng)域一個(gè)研究熱點(diǎn)。Tfh 表達(dá) CXCR5，這使得它們能夠歸巢到淋巴結(jié)的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞區(qū)域之間的界面，它們通過(guò)抗原呈遞與B 細(xì)胞相互作用，在促進(jìn)B 細(xì)胞分化和親和力成熟中起著不可或缺的作用。因此HIV 對(duì)于TFH 活性的影響直接影響患者體液免疫功能的發(fā)揮。2018 年Sci Immunol.發(fā)表的Wendel BS 等人關(guān)于HIV 慢性感染者TFH 的研究。利用質(zhì)譜流式對(duì)病人淋巴結(jié)T 細(xì)胞進(jìn)行了37 個(gè)marker 的同時(shí)檢測(cè)，通過(guò)進(jìn)行tSNE 和DenVM 分析，作者發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，HIV 患者具有更多的CD38+TFH 細(xì)胞，具有單一表達(dá)IL-21 的激活型表型。(如圖2)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在慢性感染階段TFH 細(xì)胞依然可以對(duì)HIV 抗原做出反應(yīng)，但在持續(xù)抗原刺激作用下功能發(fā)生傾斜，僅具有非常有限的TCR 克隆譜系[2] ；
左圖：全部細(xì)胞的亞群組成，中圖右圖顯示健康對(duì)照和HIV患者，圖片來(lái)源文獻(xiàn)[2]
? ? ? ? 此外，質(zhì)譜流式還可以幫助研究者發(fā)現(xiàn)一些疾病相關(guān)的新亞群，揭示發(fā)病過(guò)程一些新的免疫機(jī)制。2019年Del Alcalza D等人利用質(zhì)譜流式檢測(cè)了HIV感染的淋巴結(jié)T細(xì)胞上36個(gè)marker的表達(dá)，系統(tǒng)分析了CD4+T細(xì)胞的亞群組成。研究發(fā)現(xiàn)，患者淋巴結(jié)內(nèi)存在一群可以分泌IL-21的CXCR5-細(xì)胞。后續(xù)的細(xì)胞功能試驗(yàn)和TCR受體測(cè)序結(jié)果說(shuō)明其具有和TFH類(lèi)似的功能，并具有部分重合的TCR克隆譜系，同時(shí)該群細(xì)胞對(duì)外周血CXCR5-CD4+T cells也有貢獻(xiàn)。這些信息串在一起，揭示了一個(gè)在HIV慢性感染過(guò)程中連接淋巴結(jié)病理學(xué)和循環(huán)T細(xì)胞的新機(jī)制，拓展了我們對(duì)于T調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能多樣性的認(rèn)識(shí)。[5]。
2）CD8+ T
? ? ? ? 耗竭型CD8+T細(xì)胞是HIV進(jìn)入慢性感染的標(biāo)志。2018年Bengsch等人利用質(zhì)譜流式對(duì)患者耗竭型CD8+T(Tex)的表型進(jìn)行了深入研究。基于前期表觀(guān)遺傳的數(shù)據(jù)，作者篩選了16多個(gè)與功能耗竭相關(guān)marker加入質(zhì)譜流式Panel進(jìn)行分析，從單細(xì)胞的水平分析Tex的耗竭表型。經(jīng)過(guò)PhenoGraph聚類(lèi)，他們得到了在9個(gè)表型不同的Tex細(xì)胞亞群，定義了不同抑制性受體在各個(gè)Tex亞群上的表達(dá)組合模式。然后，根據(jù)他們的比例信息，制作了表征疾病狀態(tài)的指標(biāo)。這對(duì)于研究慢性感染，自身免疫和癌癥中的免疫監(jiān)測(cè)和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制都具有重要意義(如圖3)。[1]
（圖片來(lái)源文獻(xiàn)[1]）
3）其他免疫細(xì)胞
? ? ? ? 此外，還有多想研究通過(guò)質(zhì)譜流式分別對(duì)于HIV感染者DC、NK、PMN，Macrophage等其他免疫亞群的深入的表型和功能分析。他們的研究從不同側(cè)面展示了HIV感染對(duì)于人體免疫系統(tǒng)帶來(lái)的巨大影響，揭示了HIV感染過(guò)程中，慢性免疫激活的建立和維持，以及最后導(dǎo)致免疫衰竭的諸多重要分子機(jī)制。[9][10][11][15][7]
? ? ? ? 在A(yíng)RT治療過(guò)程中，伴隨病毒水平的降低，免疫細(xì)胞各種marker的表達(dá)及功能活性也發(fā)生了復(fù)雜的變化，這些現(xiàn)象對(duì)于研究ART治療的作用機(jī)制，探索更有有效的治療手段至關(guān)重要。質(zhì)譜流式以其多通道的優(yōu)勢(shì)，有力了支持了這些方向研究。
? ? ? ? 2019年 Bekele Y為首的研究小組利用質(zhì)譜流式分析了在不同感染期接受ART治療的病人外周血樣本，通過(guò)對(duì)比研究人員發(fā)現(xiàn)，急性感染期開(kāi)始ART治療的病人比慢性期開(kāi)始ART治療的病人具有更豐富的CD27, CD28, CD127, CD44高表達(dá)T細(xì)胞亞群，這提示前者保留了更好的免疫功能。[6]
小結(jié)：
? ? ? ? 綜上，通過(guò)單細(xì)胞水平的多參數(shù)檢測(cè)，質(zhì)譜流式可以全面系統(tǒng)的分析分析HIV病毒感染不同階段以及治療過(guò)程中免疫系統(tǒng)的表型和功能改變，為人類(lèi)進(jìn)一步了解和控制該疾病提供了有益的探索。在腫瘤等其他疾病的研究中，科研人員已經(jīng)通過(guò)質(zhì)譜流式找到了一些用于臨床診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[22,23]，相信未來(lái)在HIV的研究領(lǐng)域，還將有更多的更加貼近臨床的研究和發(fā)現(xiàn)。
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