編者按
人體腸道類(lèi)器官(hIOs)由于具有自我更新和分化能力，可以模擬腸道的簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)和功能。因此，hIOs已成為研究人類(lèi)腸道發(fā)育和功能特性的體外模型系統(tǒng)。然而，由于腸道干細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)器官結(jié)構(gòu)不規(guī)則，且在可重復(fù)性和大規(guī)模培養(yǎng)的方面受到限制，因此不具有廣泛實(shí)用性。
標(biāo)準(zhǔn)化的腸道干細(xì)胞(ISCs)培養(yǎng)方法可為培養(yǎng)同質(zhì)、規(guī)模化的腸類(lèi)器官提供合理的解決方案，ISCs在體外可以迅速擴(kuò)增，是最有前途的腸上皮再生移植細(xì)胞來(lái)源。因此體外培養(yǎng)的ISC可以作為模型系統(tǒng)來(lái)研究ISC生物學(xué)和基因編輯細(xì)胞來(lái)源，從而可以作為成功模擬人類(lèi)腸道的正常生理和病理的體外模型。
氣液培養(yǎng)(ALI)在類(lèi)器官培養(yǎng)方面日益增多，在氣液培養(yǎng)中，基態(tài)干細(xì)胞繁殖穩(wěn)定，基因組不穩(wěn)定，容易高效地分化為腸上皮細(xì)胞，更好的模擬體內(nèi)腸道功能。將ISC與氣液培養(yǎng)相結(jié)合，穩(wěn)定產(chǎn)生突出絨毛樣結(jié)構(gòu)的2.5D腸上皮模型。該技術(shù)為研究人類(lèi)ISC及其在再生醫(yī)學(xué)和疾病建模方面的潛在應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的工具。
2024年1月27日 ，韓國(guó)科技大學(xué)韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所（KRIBB）的Mi-Young Son研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=16.6）上發(fā)表了最新研究成果，該研究建立了一種在新條件下擴(kuò)增的人腸道干細(xì)胞(ISC)培養(yǎng)方法，結(jié)合在最低限度培養(yǎng)基中的氣液界面培養(yǎng)，使ISC3D-hIO分化為具有細(xì)胞多樣性、絨毛樣結(jié)構(gòu)和屏障完整性的腸上皮，且ISC3D-hIO是基因編輯研究ISC生物學(xué)和腸道疾病移植的理想細(xì)胞源，可以為再生醫(yī)學(xué)和疾病建模提供了一種生物工具。
文章題目
Chemically-defned and scalable culture system for intestinal stem cells derived fromhuman intestinal organoids
雜志：Nature Communications（IF=16.6）
發(fā)表時(shí)間：2024.1.27
作者：Mi-Young Son等
單位：韓國(guó)科技大學(xué)韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所（KRIBB）
01、研究結(jié)果
1. 成功建立無(wú)需飼養(yǎng)層的人源ISC
為了建立一種獲得可持續(xù)培養(yǎng)ISCs的方法，研究者從人多能干細(xì)胞(hPSC)衍生的3D hIO中分離出ISC3D-hIO，并且測(cè)試了幾種類(lèi)型的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)來(lái)代替飼養(yǎng)層細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ISC3D-hIO與明膠或I型膠原相比，在涂有1%基質(zhì)凝膠的表面上可以更有效地生長(zhǎng)和增殖。
圖1
為了優(yōu)化ISC3D-hIO分離和擴(kuò)增的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，研究者們?cè)u(píng)估了先前報(bào)道的參與體外人類(lèi)結(jié)腸隱窩維持的各種生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)因子的組合，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加RSPO1、EGF和PGE2對(duì)于ISC3D-hIO培養(yǎng)是必不可少的，因此制定了化學(xué)培養(yǎng)成份確定的ISC3D-hIO培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。
圖2
2. 單細(xì)胞分辨率下ISC3D-hIO細(xì)胞組成分析
為驗(yàn)證上一步分離擴(kuò)增出來(lái)的細(xì)胞準(zhǔn)確類(lèi)型，以便于實(shí)驗(yàn)的下一步進(jìn)行。研究者們通過(guò)單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)系統(tǒng)對(duì)ISC3D-hIO的細(xì)胞組成進(jìn)行了分析。通過(guò)對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)記物(EPCAM、CDH1)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(MFAP4、COL1A2、DCN)、細(xì)胞周期以及與胎兒ISC標(biāo)記基因(LDHB、EIF3E、SOX9和SHH)的表達(dá)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，研究者們提取出的 ISC3D-hIO細(xì)胞主要由干細(xì)胞和祖細(xì)胞組成，且分化的細(xì)胞相對(duì)較少。
圖3
3. 采用氣液界面(ALI)培養(yǎng)向2.5D腸上皮分化
體外腸上皮培養(yǎng)物與體內(nèi)的人腸組織形態(tài)功能相似，便于在體外進(jìn)行腸道功能的分析和應(yīng)用。在Transwell中將ISC3D-hIO進(jìn)行ALI培養(yǎng)，使其分化為具有絨毛樣突出結(jié)構(gòu)的腸上皮，建立具有人腸道結(jié)構(gòu)和細(xì)胞多樣性等特性的體外培養(yǎng)模型。
在特定的營(yíng)養(yǎng)條件下，ISC3D-hIO所表達(dá)的分化標(biāo)志物表達(dá)逐漸提升，且衍生的上皮形成絨毛圖案，HE染色切片顯示，隨著ALI培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，絨毛樣皺襞的厚度顯著增加，最終形成完整的上皮。通過(guò)分析ISC3D-hIO和ALI條件下培養(yǎng)的ISC3D-hIO細(xì)胞的相關(guān)成熟分化的RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)在ALI條件下，ISC3D-hIO具有分化為功能性腸上皮的能力，且分化程度高于正常條件下培養(yǎng)的ISC3D-hIO。
圖4
4. ISC3D-hIO在基因編輯和移植中的應(yīng)用
ISC3D-hIO生長(zhǎng)迅速，在可控的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，適合用于各種應(yīng)用研究。為了研究新模型的適用范圍，研究者們使用慢病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因ISC3D-hIO細(xì)胞系。對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)之后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，并通過(guò)ALI培養(yǎng)可以順利分化為可以被標(biāo)記的3D hIOs和2.5D腸上皮模型，結(jié)果表明，ISC3D-hIO可以應(yīng)用于基因組編輯技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞系。
圖5
為進(jìn)一步研究腸上皮模型的應(yīng)用價(jià)值，研究者們將ISC3D - hIO移植到EDTA損傷的NOD/SCID缺失IL2Rg基因(NIG)小鼠的結(jié)腸上皮中，觀察2周以評(píng)估其再生潛力。結(jié)果顯示，ISC3D-hIO移植組在原位表現(xiàn)活躍，腸道重量以及損傷程度均有改善，在植入部位有隱窩結(jié)構(gòu)形成。表明ISC3D-hIO是一種可植入的組織再生來(lái)源，能夠形成腸上皮結(jié)構(gòu)。
圖6
5. 嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染ali分化腸上皮的模型研究
為證明ALI培養(yǎng)產(chǎn)生的2.5D腸上皮是模擬宿主-病原體相互作用關(guān)鍵方面的合適模型，因此研究者們?cè)噲D使用2.5D腸上皮生成SARS-CoV-2病毒感染模型。
結(jié)果顯示，每個(gè)ISC3D-hIO保留了其起源hIO的腸道成熟特異性基因表達(dá)圖譜，ISC3D -成熟的hIO腸上皮比ISC3D -控制的hIO腸上皮更容易受到病毒感染，而且當(dāng)使用可以破壞ACE2與SARS-CoV-2相互作用的化學(xué)藥物治療時(shí)，前者的受病毒感染情況得到更多的改善。因此，2.5D腸上皮模型，更適合研究宿主-病原體之間的相互作用。
圖7
02、編者點(diǎn)評(píng)
綜上，本研究開(kāi)發(fā)了一種源于3D人腸腸道類(lèi)器官（3D-hIO）的2D單層人ISC培養(yǎng)技術(shù)，在化學(xué)成分完全確定和無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞的情況下，細(xì)胞主要由干細(xì)胞和前體細(xì)胞組成，R-spondin 1（RSPO1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和前列腺素E2（PGE2）補(bǔ)充劑對(duì)細(xì)胞存活和增殖至關(guān)重要。該技術(shù)為研究人類(lèi)ISC以及在再生醫(yī)學(xué)和疾病建模中的潛在應(yīng)用提供了強(qiáng)大工具。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開(kāi)拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚(yú)生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚(yú)、類(lèi)器官、哺乳動(dòng)物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開(kāi)展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚(yú)模型，胃癌、腦類(lèi)器官、心臟類(lèi)器官及各種腫瘤類(lèi)器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢！