佛山市婦幼保健院科研實(shí)驗(yàn)中心自成立以來(lái)，一直致力于共生微生物與腫瘤的基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。最近，本中心蘇冀彥副研究員以第一作者身份在Gut Microbes（中科院一區(qū)，Impact factor：12.2）發(fā)表題為“Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: Inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation”的研究論文（通訊作者為實(shí)驗(yàn)中心主任夏承來(lái)研究員、廣東省中醫(yī)院陳前軍教授以及廣東省科學(xué)院微生物研究所謝意珍研究員）。此外，該研究成果已形成授權(quán)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利一項(xiàng)（專(zhuān)利號(hào)：ZL 2022 1 1572648.7）。（麥特繪譜提供個(gè)性化靶向定制檢測(cè)服務(wù)）
在本論文中，我們首先發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者腸道菌群的α-多樣性和β-多樣性也與良性乳腺疾病患者有顯著差異。在構(gòu)成該差異的特異性微生物物種中，Prevotella屬的相對(duì)豐度和流行率均顯著高于對(duì)照組患者，且其在65歲以下乳腺癌患者中的相對(duì)豐度和流行率仍顯著高于對(duì)照組人群。已有文獻(xiàn)報(bào)道， Prevotella copri是Prevotella屬中最為常見(jiàn)的一個(gè)種，也廣泛存在于人腸道微生物中。我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，P. copri在所有年齡段和65歲以下乳腺癌患者中的相對(duì)豐度和流行率也顯著高于對(duì)照組。有趣的是，課題組更早發(fā)表的論文也表明乳腺癌荷瘤小鼠的腸道菌群也含有更高豐度的Prevotella屬，提示P. copri的富集與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
圖1. 乳腺癌患者腸道菌群多樣性有別于良性乳腺疾病患者，且其中P. copri異常富集，提示P. copri的富集與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)
基于上述臨床分析結(jié)果，課題組進(jìn)一步觀察P. copri屬對(duì)乳腺癌發(fā)展的具體作用。課題組分別在無(wú)特定病原體(Specific pathogen-free，SPF)小鼠和無(wú)菌(Germ-free，GF)小鼠中構(gòu)建4T1乳腺癌模型，觀察灌胃給予P. copri(2.5×109cfu/mouse，每周1次)對(duì)腫瘤組織生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在SPF小鼠還是GF小鼠中，灌胃給予P. copri均可顯著促進(jìn)4T1細(xì)胞形成的腫瘤的生長(zhǎng)，其腫瘤生長(zhǎng)速度、最終瘤重均顯著提高，且最終P. copri在SPF小鼠糞便和小腸內(nèi)容物的微生物中的殘余比例更高，更在GF小鼠糞便微生物中占據(jù)絕對(duì)地位。
圖2. 過(guò)量P. copri的定植可促進(jìn)乳腺癌荷瘤小鼠的腫瘤組織生長(zhǎng)
然而有趣的是，課題組發(fā)現(xiàn)P. copri的分泌物無(wú)法直接促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但我們通過(guò)靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，通過(guò)灌胃給予P. copri使其在宿主體內(nèi)過(guò)量定植，可使SPF荷瘤小鼠和GF荷瘤小鼠血清中吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvic acid，IPyA）急劇降低，且下降幅度最大，同時(shí)其前體色氨酸(Tryptophan，Trp)也在SPF小鼠中顯著下降。Trp是人體無(wú)法自身合成的必須氨基酸之一，在人體內(nèi)其主要由腸道微生物中的色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylases，Tph)代謝為IPyA。課題組通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，P. copri可大量代謝Trp而生成極少量的IPyA。同時(shí)，我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，灌胃給予IPyA（120mg/kg，每天1次）可以明顯抑制SPF荷瘤動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明，P. copri促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)的過(guò)程中伴隨著宿主體內(nèi)IPyA的劇減，提示我們P. copri的過(guò)量定植可耗竭宿主IPyA，從而顯著削弱宿主抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)。
圖3. P. copri的過(guò)量定植可耗竭宿主IPyA，從而顯著削弱宿主抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)
課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在與生理濃度接近的實(shí)驗(yàn)濃度下（約2mM），IPyA對(duì)鼠源乳腺癌細(xì)胞株4T1有直接細(xì)胞毒作用，抑制其增殖和克隆形成能力。此前，課題組通過(guò)蛋白組學(xué)和簡(jiǎn)并代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)(Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)發(fā)現(xiàn)P. copri使腫瘤組織的變化集中在UHRF1調(diào)控的AMPK通路上。另一方面，在IPyA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡的過(guò)程中，IPyA可使細(xì)胞中UHRF1，DMMT3A和DNMT1表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)AMPK磷酸化。IPyA也對(duì)細(xì)胞中AMPK通路相關(guān)基因mRNA水平產(chǎn)生影響，其中使cftr的mRNA水平下調(diào)，而使pfkfb3, pparg, scd1和lepr的mRNA水平上調(diào)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)cftr的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平被IPyA上調(diào)，與其mRNA水平下調(diào)的情況相互吻合。
圖4. IPyA對(duì)乳腺癌細(xì)胞有直接細(xì)胞毒作用
Xu等（Cell Res, 2022. 32(1): 54-71，doi：10.1038/s41422-021-00565-y）發(fā)現(xiàn)UHRF1是AMPK活性的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)IPyA抑制了UHRF1和PP2A C的核內(nèi)分布，同時(shí)提高了細(xì)胞總體的AMPK磷酸化水平，與Xu等的發(fā)現(xiàn)相符。此外，我們還發(fā)現(xiàn)IPyA在促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AMPK磷酸化的同時(shí)，線(xiàn)粒體磷酸化（Mitochondrial oxidative phosphorylation）途徑生成的ATP（mitoATP）和糖酵解（Glycosis）途徑生成的ATP（glyATP）均大量減少，導(dǎo)致細(xì)胞總ATP生成急劇下降；同時(shí)，mitoATP的占比明顯下降而glyATP占比明顯上升，這些正是AMPK被激活的表現(xiàn)。綜上所述，IPyA可通過(guò)逆轉(zhuǎn)UHRF1介導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)，激活A(yù)MPK，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行能量代謝重編程，抑制細(xì)胞能量生成，從而抑制細(xì)胞增殖。最后，課題組在另一個(gè)鼠源乳腺癌系中再次驗(yàn)證了P. copri的促癌作用和IPyA的抑癌作用。以上結(jié)果表明，IPyA對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用與P. copri對(duì)乳腺癌促進(jìn)作用完全相反。此前已經(jīng)證明P. copri的增多導(dǎo)致了IPyA耗竭，這正是P. copri促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的關(guān)鍵原因。
圖5. IPyA可通過(guò)逆轉(zhuǎn)UHRF1介導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)，激活A(yù)MPK，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行能量代謝重編程，抑制細(xì)胞能量生成，從而抑制細(xì)胞增殖
圖6. P. copri的促癌作用和IPyA的抑癌作用在另一個(gè)鼠源乳腺癌細(xì)胞系EMT-6中再次得到驗(yàn)證
本研究獲國(guó)家自然科學(xué)基金（青年基金項(xiàng)目和面上項(xiàng)目）、福建省自然科學(xué)基金、佛山市科技局、佛山市登峰計(jì)劃資助。
參考文獻(xiàn)：
[1]Su, J., et al. (2024). Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: Inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation. Gut Microbes, 2024. 16(1): 2347757.
[2]Xu, X., et al. (2022). Nuclear UHRF1 is a gate-keeper of cellular AMPK activity and function. Cell Res 32(1): 54-71.
供稿：蘇冀彥副研究員
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