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#1

1、通過微生物組分析發(fā)現(xiàn)，高脂飲食顯著降低了菌群的α多樣性，并鑒定出15個差異豐度菌屬，其中Lactococcus豐度明顯升高、Turicibacter明顯降低，且Firmicutes/Bacteroidota比值呈品系特異性變化。

2、通過靶向膽汁酸檢測以及關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，普通飼料條件下，香農(nóng)指數(shù)（菌群多樣性）與糞便、肝臟和血漿中的次級膽汁酸/初級膽汁酸（secondary BA/primary BA）比值呈正相關(guān)。而在高脂飲食喂養(yǎng)后這些相關(guān)性便消失了，高脂飲食破壞了微生物群與膽汁酸代謝的相互作用。

3、通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因（Saa1、Saa3）上調(diào)，抑癌基因（Cyp2c55）及腸道保護(hù)基因（Ces2a）下調(diào)。進(jìn)一步通過稀疏典型相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，高脂飲食特異性地誘導(dǎo)了腸道菌群與宿主炎癥、免疫相關(guān)基因通路（如干擾素反應(yīng)、白細(xì)胞介素信號）的關(guān)聯(lián)。

4、進(jìn)一步鑒定出4個與菌群-膽汁酸互作相關(guān)的共定位遺傳位點(diǎn)：gMxB1調(diào)控正常飲食下Turicibacter sanguinis的豐度與血漿/肝臟中的膽酸、鵝去氧膽酸水平。gMxB2調(diào)控正常飲食下 T. sanguinis 的豐度與肝臟膽酸水平。gMxB3調(diào)控高脂飲食下Bacteroides uniformis的豐度與糞便中的α-MCA、TLCA、UDCA水平。gMxB4調(diào)控高脂飲食下Bacteroides屬的豐度與糞便中的7-酮基-LCA和DCA水平。

#2

1、通過臨床試驗分析發(fā)現(xiàn)，在III期高劑量試驗中，VOS治療組8周復(fù)發(fā)率僅12%，顯著低于安慰劑組（40%）。

2、通過微生物組分析發(fā)現(xiàn)，III期高劑量VOS的植入率顯著高于安慰劑組，VOS組厚壁菌門豐度顯著升高，變形菌門豐度顯著降低，且艱難梭菌及條件致病菌的豐度也顯著低于安慰劑組。

3、通過靶向膽汁酸檢測發(fā)現(xiàn)，VOS 治療后，初級膽汁酸（膽酸、鵝去氧膽酸）濃度顯著降低，次級膽汁酸（脫氧膽酸、石膽酸）濃度顯著升高。進(jìn)一步通過脂肪酸檢測發(fā)現(xiàn)，VOS顯著提高了短鏈及中鏈脂肪酸（如丁酸、戊酸和己酸）的水平。

4、體外實驗進(jìn)一步證實丁酸、戊酸和己酸能抑制艱難梭菌生長，且抑制效果隨碳鏈長度增加而增強(qiáng)。

#3

1、首先，通過對GMrepo數(shù)據(jù)庫的分析以及115例UC患者糞便樣本的qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)P. excrementihominis在活動期UC患者中的豐度顯著升高，且其水平與Mayo評分呈正相關(guān)。在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中進(jìn)一步驗證，僅活菌及其培養(yǎng)上清能夠加重結(jié)腸炎癥并促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤；利用Ly6G中和抗體耗竭中性粒細(xì)胞或采用PADI4基因敲除小鼠進(jìn)行實驗，表明該菌主要通過激活NETosis途徑加劇腸道炎癥。

2、其次，通過多組學(xué)技術(shù)闡明P. excrementihominis的代謝調(diào)控機(jī)制。對無菌小鼠進(jìn)行單菌定植后，利用RNA測序和非靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該菌顯著增強(qiáng)宿主的碳水化合物代謝能力，導(dǎo)致其特異性代謝產(chǎn)物琥珀酸（Suc）和6-羥基己酸（6-HHA）在糞便、血清及細(xì)菌上清中顯著積累。體外實驗證實，這兩種代謝物能夠選擇性激活經(jīng)LPS預(yù)刺激的中性粒細(xì)胞，上調(diào)NETs相關(guān)基因表達(dá)，并通過分子對接驗證其與GPR84/SUCNR1受體的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化及GSDMD切割，最終驅(qū)動NETs形成。

3、進(jìn)一步地，在AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC模型中，灌胃P. excrementihominis或直接補(bǔ)充Suc與6-HHA均顯著增加結(jié)腸腫瘤負(fù)荷并上調(diào)NETs標(biāo)志物表達(dá)；而在中性粒細(xì)胞特異性GSDMD缺失小鼠中，上述促腫瘤效應(yīng)明顯減弱，證實GSDMD依賴性NETosis在代謝物驅(qū)動的腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4、最后，通過衰老模型與飲食干預(yù)實驗，揭示了環(huán)境因素對P. excrementihominis定植及其致病性的調(diào)控作用。通過對老年與年輕小鼠進(jìn)行16S rRNA測序分析，發(fā)現(xiàn)老年小鼠腸道中P. excrementihominis豐度顯著升高；進(jìn)一步的糞菌移植實驗證實，老年供體菌群可加速年輕受體小鼠的CAC發(fā)展。飲食干預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，高碳水化合物飲食促進(jìn)P. excrementihominis的定植與擴(kuò)張，而生酮飲食則能有效抑制其生長，為通過膳食策略靶向該致病菌提供了實驗依據(jù)。

#4

1、首先，對攜帶APC基因突變的轉(zhuǎn)基因豬模型進(jìn)行為期3個月的飲食干預(yù)。結(jié)果顯示，高紅肉與豬油飲食顯著增加結(jié)腸息肉數(shù)量和大小，伴隨上皮細(xì)胞增殖加劇，糞便中DCA等次級膽汁酸水平也明顯升高。在此基礎(chǔ)上，使用膽汁酸螯合劑考來替蘭（COL）處理發(fā)現(xiàn)，COL能有效抑制飲食誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞增殖，減少進(jìn)展性息肉比例，并促進(jìn)膽汁酸隨糞便排出，說明通過阻斷膽汁酸吸收可緩解西方飲食的促瘤作用，初步確立了膽汁酸在CRC進(jìn)展中的功能角色。

2、進(jìn)一步通過分析多個人群隊列的宏基因組數(shù)據(jù)，鑒定出與CRC密切相關(guān)的特定7αDH+細(xì)菌。宏基因組操作分類單元（mOTU）分析表明，Clostridium scindens和C. hylomona的bai基因簇在CRC患者糞便中富集。隨后在定植簡化菌群（BACOMI）的無菌小鼠模型中證實，引入C. scindens可誘導(dǎo)DCA生成，激活結(jié)腸上皮中與增殖、分化相關(guān)的信號通路，并顯著增加Ki67+細(xì)胞數(shù)量，說明特定菌株可通過產(chǎn)生DCA直接驅(qū)動上皮增殖。

3、為在體內(nèi)驗證7αDH+菌對腫瘤形成的直接影響，在化學(xué)誘導(dǎo)和遺傳誘導(dǎo)的小鼠CRC模型中進(jìn)行實驗。結(jié)果顯示，定植C. scindens或E. muris的小鼠結(jié)腸中DCA水平升高，腫瘤數(shù)量（尤其小型腫瘤）顯著增加。而使用7αDH活性缺失的F. contorta突變菌株則無法誘導(dǎo)DCA產(chǎn)生或增加腫瘤負(fù)荷，表明細(xì)菌的7αDH活性是結(jié)腸腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動因素。

4、最后，利用人結(jié)腸類器官模型在體外驗證DCA的直接促增殖作用。類器官暴露于野生型F. contorta（含DCA）的培養(yǎng)上清后，Ki67+細(xì)胞比例顯著上升，而突變菌株上清無此效應(yīng)，說明細(xì)菌來源的DCA可直接促進(jìn)人結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖，為其促瘤機(jī)制提供了直接證據(jù)。

#5

1、16S rRNA擴(kuò)增子測序+PICRUSt2：FO化療后Firmicutes門及Clostridia綱擴(kuò)張，色氨酸代謝通路顯著富集；門靜脈血IPA（吲哚丙酸）升高>10倍且持續(xù)10天以上，抗生素清除菌群后IPA升高消失，證實IPA來源于化療誘導(dǎo)的菌群失調(diào)。

2、LC-MS代謝組：非靶向代謝組檢出95種上調(diào)代謝物中IPA最顯著；靶向定量顯示FO組IPA超對照組10倍；臨床隊列（n=14）中64%CRC患者化療后IPA升高，且與單核細(xì)胞計數(shù)顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.59，P=0.002）。

3、流式細(xì)胞術(shù)+CyTOF成像：IPA使Ly6C^high CCR2⁺免疫抑制性單核細(xì)胞減少40-50%，MHCII+髓系細(xì)胞增加；Th1（T-bet⁺IFN-γ⁺）效應(yīng)細(xì)胞比例上升，Treg顯著減少；CD8⁺T細(xì)胞與Th1空間共定位增強(qiáng)，與Treg相互作用消失。

4、骨髓造血功能研究（CFU+RNA-seq+SCENIC）發(fā)現(xiàn)：IPA直接抑制骨髓CFU形成，促使共同髓系祖細(xì)胞（CMP）向巨噬細(xì)胞分化而非Ly6C^high單核細(xì)胞；激活Rbpj/Irf8/Mafb巨噬細(xì)胞分化網(wǎng)絡(luò)，抑制未成熟髓系特征基因（Ms4a3等）。

5、功能驗證與臨床轉(zhuǎn)化：CD4⁺T細(xì)胞耗竭完全消除IPA的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)；IPA聯(lián)合化療顯著降低腫瘤負(fù)荷（P<0.0001）；高單核細(xì)胞（>0.8 G/L）預(yù)示CRC患者較差總生存期（P<0.0001），提示IPA可作為化療佐劑通過重編程髓系造血增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

#6

1、16S rRNA擴(kuò)增子測序：將802例樣本劃分為4個代謝亞群，Cluster-3/4的菌群結(jié)構(gòu)、α-多樣性及共豐度網(wǎng)絡(luò)與Cluster-1/2顯著不同；鑒定49個差異 ASV，獲益組（Cluster-3/4）干預(yù)后Guild-2（產(chǎn)丁酸/乙酸）/Guild-1（耐藥）比值升高，Parabacteroides distasonis等9個纖維響應(yīng)菌顯著富集。

2、PICRUSt2功能預(yù)測：發(fā)現(xiàn)Guild-2富集碳水化合物利用及SCFA生成基因；Guild-1富集藥物耐藥與細(xì)菌毒力基因，證實兩派菌群功能對立。

3、血清非靶向LC-MS代謝組：Cluster-3/4干預(yù)后49–61種代謝物顯著改變，芳香族及支鏈氨基酸代謝通路下調(diào)，與菌群SCFA產(chǎn)生同步增強(qiáng)。

4、LightGBM機(jī)器學(xué)習(xí)+SHAP 解釋：以基線44個ASV建立預(yù)測模型，ROC-AUC達(dá)0.81；計算微生物-纖維評分（MFS），cut-off以17/25為截點(diǎn) 在訓(xùn)練集與兩個獨(dú)立驗證隊列均以99–100%準(zhǔn)確率區(qū)分高/低響應(yīng)者。

#7

1、動物模型構(gòu)建與飲食干預(yù)：高氨基酸飲食在無菌（GF）小鼠中顯著促進(jìn)腫瘤生長，但在特定病原體（SPF）小鼠中該效應(yīng)被削弱。

2、人糞便微生物移植給抗生素處理小鼠：16S rRNA測序分析發(fā)現(xiàn)，被移植氨基酸高消耗效率微生物的小鼠，血清和糞便氨基酸水平更低，腫瘤負(fù)擔(dān)顯著高于低消耗效率組。

3、bo-ansB基因的功能驗證與機(jī)制探究：擬桿菌屬的bo-ansB基因核心功能是編碼天冬酰胺酶，可消耗腸道及腫瘤微環(huán)境中的天冬酰胺（Asn），導(dǎo)致腫瘤浸潤C(jī)D8?T細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性和效應(yīng)功能受損，腫瘤進(jìn)展加快。

4、結(jié)直腸癌模型與人類隊列分析：結(jié)果顯示，Δbo-ansB（敲除bo-ansB基因）定植的結(jié)腸癌小鼠腫瘤負(fù)擔(dān)減輕、CD8⁺T細(xì)胞功能增強(qiáng)。人類中ansB、argD等微生物氨基酸消耗基因豐度與結(jié)直腸癌進(jìn)展相關(guān)，ansB豐度與糞便Asn水平呈負(fù)相關(guān)。

#8

1、基因篩選與驗證：結(jié)合多數(shù)據(jù)庫驗證，確定RNF32為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移關(guān)鍵驅(qū)動基因，其高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)。

2、體內(nèi)外功能驗證：RNF32可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及體內(nèi)腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移。

3、分子機(jī)制探究：采用RNA測序、蛋白相互作用實驗、泛素化實驗等，發(fā)現(xiàn)RNF32通過△2結(jié)構(gòu)域結(jié)合GSK3β的D3結(jié)構(gòu)域，催化其K60位點(diǎn)K48連接泛素化降解，激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路驅(qū)動EMT。

4、腫瘤微環(huán)境調(diào)控：經(jīng)質(zhì)譜流式、巨噬細(xì)胞耗竭、條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)等實驗，揭示RNF32通過Wnt通路上調(diào)CCL2，激活巨噬細(xì)胞CCR2/FABP1/PPARG軸誘導(dǎo)SPP1表達(dá)，SPP1⁺巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞CD44結(jié)合增強(qiáng)干細(xì)胞特性，重塑免疫抑制微環(huán)境。

5、藥物篩選與驗證：通過虛擬篩選、分子對接及微量熱泳動（MST）驗證，發(fā)現(xiàn)吲哚-3-乙酸（IAA）為RNF32高親和力抑制劑；體內(nèi)外實驗證實IAA可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、腫瘤生長及肝轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)免疫抑制，且生物安全性良好。