Nat Commun（IF 14.9）| 組學(xué)領(lǐng)軍大牛Matthias Mann利用DIA磷酸化組深度剖析促炎信號通路-自主發(fā)布-資訊-生物在線

Nat Commun（IF 14.9）| 組學(xué)領(lǐng)軍大牛Matthias Mann利用DIA磷酸化組深度剖析促炎信號通路

作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-30T18:51 (訪問量:4050)

腫瘤壞死因子(TNF)通路是一個高度依賴蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控的重要的促炎信號通路。臨床上，靶向TNF在治療炎癥方面非常成功，但抗炎療法可能會引起嚴(yán)重的副作用。由于TNF相關(guān)磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)未得以全面剖析，因此亟需更系統(tǒng)的方法深入了解其中激酶、磷酸酶、底物關(guān)系及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)變化，為藥物干預(yù)提供靶點(diǎn)，幫助更精確地控制疾病。

今年10月，蛋白組學(xué)領(lǐng)軍大牛Matthias Mann教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications上發(fā)表了題為 “Phosphoproteome profiling uncovers a key role for CDKs in TNF signaling”的論文，利用高深度的DIA磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)深入解析了TNF下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化，從功能上探討了TNF及其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中蛋白磷酸化變化，并揭示了CDK激酶在其中的關(guān)鍵調(diào)控作用，為抗炎治療等提供潛在藥物干預(yù)靶點(diǎn)。

技術(shù)路線

步驟1：通過DIA磷酸化組學(xué)，比較TNF處理不同時間磷酸化水平的變化；

步驟2：抑制關(guān)鍵激酶并揭示激酶和底物的關(guān)系；

步驟3：分離細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，通過組學(xué)研究TNF誘導(dǎo)的磷酸化引起的蛋白易位；

步驟4：研究TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中蛋白和磷酸化水平的變化；

步驟5：抑制CDK激酶，通過蛋白組學(xué)研究CDK的作用。

研究結(jié)果

1. TNF誘導(dǎo)磷酸化水平隨時間變化，可區(qū)分早期和晚期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動

為系統(tǒng)描繪TNF相關(guān)磷酸化變化網(wǎng)絡(luò)，對TNF處理不同時間后U937細(xì)胞進(jìn)行DIA磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定到28,000條高可信度的磷酸化肽段。結(jié)果顯示，磷酸化水平在處理3min后顯著上調(diào)，15min達(dá)到峰值，大多數(shù)在60min后恢復(fù)到基線水平(圖1d,e,f)。進(jìn)一步分析表明，許多參與NF-κB、模式識別信號通路為瞬時變化修飾蛋白，少數(shù)轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白為較為持久修飾蛋白，其磷酸化在TNF刺激后60分鐘仍保持上調(diào) (圖1f)。綜上，可根據(jù)蛋白磷酸化變化時序區(qū)分早期(5分鐘)、中期(15分鐘)、晚期(60分鐘)信號活動。

圖1 TNF調(diào)控下不同時間的磷酸化信號活動

2. TNF刺激下的激酶-底物關(guān)系分析

為進(jìn)一步揭示激酶-底物關(guān)系，使用特定抑制劑去抑制關(guān)鍵激酶活性，并進(jìn)行磷酸化組學(xué)分析。結(jié)果表明，對于通過激活NF-κB等上游通路的激酶而言，如TAK1，其活性抑制后幾乎消除了TNF相關(guān)的磷酸化變化(圖2c)。相反，抑制下游激酶如IKK1/2、p38、MEK1/2和JNK則不能完全消除TNF作用(圖2c)。進(jìn)一步在STRING網(wǎng)絡(luò)中分析激酶與底物關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在TNF刺激下磷酸化的蛋白質(zhì)并未與其他磷酸化蛋白緊密相關(guān) (圖2d)。同時，有些蛋白不受TAK1抑制影響，但受到IKK1/2抑制的強(qiáng)烈影響(圖2e)，表明IKK1/2發(fā)揮了一些不依賴于TAK1活性的功能。總之，該分析全面揭示了TNF刺激下的激酶與底物關(guān)系。

圖2 TNF刺激下的激酶-底物關(guān)系

3. TNF相關(guān)磷酸化引發(fā)蛋白質(zhì)重新定位

TNF相關(guān)磷酸化變化依賴于激酶及其底物的重新定位。為了分析該現(xiàn)象，比較TNF處理后，細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白及磷酸化變化，從而評估蛋白質(zhì)定位變化 (圖3a)。結(jié)果顯示，NF-κB通路、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白質(zhì)等很多蛋白質(zhì)發(fā)生定位變化（圖3d,e, f）。富集分析顯示，RIG-I通路、RNA加工體組裝的蛋白質(zhì)在膜上發(fā)生磷酸化變化，而模式識別受體信號通路和細(xì)胞遷移通路中的磷酸化在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)生變化(圖3h)，且其中多數(shù)能被TAK1抑制劑阻礙，暗示其受細(xì)胞質(zhì)中TAK1 活性調(diào)控(圖3g)。

圖3 TNF誘導(dǎo)的磷酸化影響TAK1下游信號通路成員的定位變化

4. TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡觸發(fā)強(qiáng)烈的RNA加工響應(yīng)和CDK激活

為分析TNF誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中關(guān)鍵調(diào)控的磷酸化蛋白，對TNF處理的U937細(xì)胞添加細(xì)胞凋亡和壞死抑制劑（SM、IDN-6556）誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并進(jìn)行磷酸化組學(xué)分析 (圖4b)。結(jié)果表明，RNA剪接和mRNA加工的蛋白磷酸化在凋亡過程中顯著上調(diào)(圖4c)。進(jìn)一步分析及驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該過程受到細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDKs的磷酸化變化調(diào)控，CDKs通過調(diào)節(jié)RNA聚合酶II活性來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程, 其中，CDK9 T354位點(diǎn)的磷酸化在TNF處理后上調(diào)9倍(圖4c-i)。

圖4 TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡導(dǎo)致強(qiáng)烈的RNA加工響應(yīng)及CDK激活

5. TNF靶基因的轉(zhuǎn)錄依賴于CDK激酶活性

TNF能誘導(dǎo)廣泛的靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而上述分析中已發(fā)現(xiàn)CDKs通過調(diào)節(jié)RNA聚合酶II活性調(diào)控轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步解析CDKs活性變化是否影響TNF誘導(dǎo)的靶基因表達(dá)。采用不同CDKs抑制劑處理TNF刺激的U937細(xì)胞，并進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)CDK激酶活性抑制后幾乎消除了TNF誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)變化(圖5a-5b)。隨后，又驗(yàn)證了相關(guān)靶基因CCL2 (MCP1)和CXCL10 (IP10)mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)同樣下調(diào)(圖5d)，說明該過程確實(shí)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。綜上表明，CDKs激酶活性變化調(diào)控TNF靶基因的轉(zhuǎn)錄。

圖5 CDK9和CDK12/13抑制劑影響TNF靶基因的轉(zhuǎn)錄

小結(jié)
本研究通過DIA磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)與亞細(xì)胞定位和激酶抑制劑分析相結(jié)合，深入分析了TNF受體下游的信號事件，闡明了數(shù)千個磷酸化事件的動力學(xué)、激酶底物關(guān)系和定位變化，提示了針對不同轉(zhuǎn)錄的CDKs的抑制劑可以作為抗炎劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑，深入全面的磷酸化水平的數(shù)據(jù)為后續(xù)研究提供了寶貴資源。

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