蛋白純度≥99%，65℃加熱10 min即可快速失活，對(duì)樣品中RNA無(wú)影響。
在診斷或研究由病原感染引起的疾病時(shí)，當(dāng)前的檢測(cè)方法大多針對(duì)病原體的基因組進(jìn)行診斷。然而，僅依靠檢測(cè)病原體的基因組核酸只能確認(rèn)病毒的存在，不足以反映持續(xù)感染或整合入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。例如，人乳頭瘤病毒（HPV）DNA的檢出可能只是一次性感染，不代表持續(xù)病變或癌變風(fēng)險(xiǎn)。相反，檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA水平能提供更精確信息，評(píng)估HPV在宿主體內(nèi)的基因組整合、轉(zhuǎn)錄活性及持續(xù)感染和致癌可能性。這種方法更關(guān)注“病變”而非僅僅是“感染”，有助于識(shí)別可能進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的癌前病變，避免對(duì)一次性HPV感染及其良性病變的過(guò)度探查和不必要治療。
圖1：HPV病毒感染宮頸細(xì)胞示意圖
為確保基因mRNA表達(dá)量分析的準(zhǔn)確性，必須排除樣本中基因組DNA（gDNA）的干擾，因?yàn)槠浯嬖诳赡軐?dǎo)致mRNA定量結(jié)果的誤差，有效去除mRNA樣本中的gDNA一直是一個(gè)技術(shù)難題。目前，DNase I是主流用于去除gDNA的酶，但DNase I的滅活需要在體系中額外加入EDTA，容易導(dǎo)致后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)受抑制。
翌圣Thermolabile dsDNase
針對(duì)以上問(wèn)題，翌圣生物推出了一種熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶——Thermolabile dsDNase。該酶能夠選擇性地降解雙鏈DNA，而對(duì)單鏈核酸分子幾乎沒(méi)有影響。通過(guò)裂解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，生成帶有5'-磷酸和3'-羥基末端的寡核苷酸片段。更重要的是，該產(chǎn)品具有熱敏感性，在65°C條件下可以迅速失活。相比傳統(tǒng)的DNase I，Thermolabile dsDNase更適合快速去除基因組DNA，并且與RT-PCR反應(yīng)緩沖液兼容，因此可以直接應(yīng)用于RT-PCR/qPCR等過(guò)程中，以清除gDNA污染，從而提高反轉(zhuǎn)錄效率。
圖2. Thermolabile dsDNase去除gDNA示意圖
產(chǎn)品特點(diǎn)
· 高效：只需37℃ 5 min即可消化1 μg基因組DNA；
· 純度高：蛋白純度≥99%；
· 無(wú)RNase酶殘留：對(duì)樣品中RNA無(wú)影響；
· 熱敏感：65℃加熱10 min即可快速失活，無(wú)需純化，gDNA去除與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可在同管內(nèi)完成；
· 應(yīng)用廣泛：RNA提取或反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前去除gDNA、分子診斷試劑原料中背景菌gDNA污染去除。
性能展示
1. 純度高：蛋白純度≥99%
圖3：SDS-PAGE法檢測(cè)14544ES蛋白純度結(jié)果
1. 無(wú)RNase酶殘留：對(duì)樣品中RNA無(wú)影響
圖4：20 μL反應(yīng)體系中加入20 U來(lái)自進(jìn)口廠家A、進(jìn)口廠家B和翌圣3批次Thermolabile dsDNase，同時(shí)分別加入0.5 μg 293T RNA，37℃孵育4小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，翌圣3批次Thermolabile dsDNase組RNA譜帶與陰性對(duì)照一致，進(jìn)口廠家A和進(jìn)口廠家B組RNA條帶有輕微降解，說(shuō)明翌圣3批次Thermolabile dsDNase中無(wú)RNase殘留，對(duì)樣本中RNA無(wú)影響。
1. 熱敏感：65℃加熱10 min即可快速失活
圖5：Thermolabile dsDNase熱敏感性驗(yàn)證結(jié)果圖。陰性對(duì)照組：未加dsDNase酶；陽(yáng)性對(duì)照組：反應(yīng)體系中加入0.2 U來(lái)自進(jìn)口廠家A、進(jìn)口廠家B和翌圣3批次Thermolabile dsDNase；熱處理組：反應(yīng)體系中加入20 U來(lái)自進(jìn)口廠家A、進(jìn)口廠家B和翌圣3批次經(jīng)過(guò)65℃加熱10 min處理的Thermolabile dsDNase酶。然后，分別在體系中加入1 μg小牛胸腺DNA，37℃孵育5 min。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，0.2 U Thermolabile dsDNase可消化1 μg小牛胸腺DNA，Thermolabile dsDNase經(jīng)過(guò)65℃孵育10 min可完全失活。
YEASEN相關(guān)產(chǎn)品
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產(chǎn)品定位 |
產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
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gDNA去除 |
Thermolabile dsDNase |
14544ES |
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Recombinant DNase I (RNase-free) |
10325ES |
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UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade |
10611ES |
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高性能PCR單酶系列 |
10726ES |
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11300ES |
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10303ES |
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10603ES |
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10125ES |
參考文獻(xiàn)
1. Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, and p16INK4a detection in head and neck cancers: a systematic review and meta-analysis[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.
2. Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparison of oncogenic HPV type‐specific viral DNA load and E6/E7 mRNA detection in cervical samples: results from a multicenter study[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.