CRISPR/Cas9作為一種細(xì)菌和古細(xì)菌長(zhǎng)期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，其高效的整合、切割能力一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，便受到科研工作者的關(guān)注。2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在體外切割雙鏈DNA；2013年，張鋒首次用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在原核生物 (大腸桿菌) 中實(shí)現(xiàn)基因組編輯。
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CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)為人類基因編輯提供了新的可能性，隨著近年來分子生物學(xué)的快速發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域。如：表達(dá)調(diào)控和基因功能的研究、細(xì)胞動(dòng)物模型的構(gòu)建、癌基因和藥物靶點(diǎn)的篩選，在基因治療中更是具有巨大的發(fā)展前景，為多種疾病提供了新的治療方法。
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CRISPR/Cas9技術(shù)的兩個(gè)核心元素是sgRNA和Cas9蛋白，sgRNA為根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)設(shè)計(jì)的“向?qū)А毙蛄校珻as9蛋白會(huì)根據(jù)向?qū)蛄羞M(jìn)行靶向編輯，二者缺一不可。針對(duì)sgRNA，能夠通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)sgRNA或者借助載體將sgRNA通過轉(zhuǎn)染的方法遞送到細(xì)胞內(nèi)；而Cas9蛋白，可以通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)Cas9蛋白或者借助載體將編碼Cas9蛋白的mRNA通過轉(zhuǎn)染的方法遞送到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而在胞內(nèi)翻譯成Cas9蛋白；除此之外，還可以將Cas9蛋白通過轉(zhuǎn)染技術(shù)直接遞送到細(xì)胞內(nèi)，則可省去胞內(nèi)翻譯的步驟，更快的完成編輯工作。
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根據(jù)上述遞送的形式不同，目前主流的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)采用的方法有以下幾種：
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質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系：采用sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和Cas9表達(dá)質(zhì)粒（或者采用sgRNA+Cas9共表達(dá)質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行編輯。
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RNA瞬轉(zhuǎn)體系：體外合成sgRNA及Cas9蛋白mRNA，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將兩者遞送到細(xì)胞內(nèi)，由細(xì)胞翻譯合成Cas9蛋白進(jìn)行編輯。
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蛋白瞬轉(zhuǎn)體系(RNP體系)：體外將sgRNA和Cas9蛋白混合成為RNP復(fù)合效應(yīng)物，再通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)（脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)等）將復(fù)合效應(yīng)物遞送到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行編輯。
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Cas9 RNP體系的優(yōu)勢(shì)
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無(wú)外源插入基因。RNP體系避免了外源基因插入的風(fēng)險(xiǎn)，不容易引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。與mRNA相比，Cas9蛋白更加穩(wěn)定，且形成的RNP復(fù)合物能夠提高sgRNA或crRNA+tracrRNA的穩(wěn)定性；
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低脫靶率。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染方式常導(dǎo)致Cas9蛋白在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)。RNP復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞后，Cas9蛋白在72小時(shí)內(nèi)即會(huì)降解，降低脫靶效應(yīng)；
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操作簡(jiǎn)便快捷。在體外將Cas9蛋白和sgRNA或crRNA+tracrRNA混合，轉(zhuǎn)導(dǎo)后即可進(jìn)行基因編輯。
近岸蛋白提供GMP級(jí)Cas9與科研級(jí)Cas9/Cas12a/Cas13a等Cas家族高品質(zhì)蛋白產(chǎn)品，為基因編輯保駕護(hù)航。
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產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：
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純蛋白體系，無(wú)外源基因引入風(fēng)險(xiǎn)。
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Cas9蛋白降解速度快，有效降低脫靶效應(yīng)
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無(wú)動(dòng)物來源培養(yǎng)基培養(yǎng)
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內(nèi)毒素低，無(wú)核酸內(nèi)、外切酶及RNA酶殘留
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在蛋白兩端加了核定位信號(hào)（NLS），蛋白可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因組編輯。
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體外切割效率高于90%
GMP級(jí)產(chǎn)品通過嚴(yán)格的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)與質(zhì)量管理符合GMP規(guī)范，保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。
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項(xiàng)目 |
標(biāo)準(zhǔn) |
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外觀 |
本品為澄明溶液 |
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可見異物 |
符合規(guī)定 |
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pH |
應(yīng)為6.9~7.9 |
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純度 |
SDS-PAGE電泳法，還原型應(yīng)不低于95.0% SEC-HPLC法，非還原型應(yīng)不低于95.0% |
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分子量 |
還原型應(yīng)為163±16.3kDa |
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蛋白質(zhì)濃度 |
BF法，9.5~10.5mg/ml |
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活性 |
體外切割效率，300ng可進(jìn)行90%切割 |
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細(xì)菌內(nèi)毒素 |
應(yīng)小于10EU/mg |
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宿主菌蛋白質(zhì)殘留量 |
不高于蛋白質(zhì)總量的0.005% |
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外源性DNA殘留量 |
每1mg蛋白應(yīng)不高于10ng |
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核酸內(nèi)切酶殘留 |
底物的降解不超過10% |
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核酸外切酶殘留 |
底物的降解不超過10% |
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RNA酶殘留 |
底物的降解不超過10% |
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支原體檢查 |
支原體試劑盒法，應(yīng)為陰性 |
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重金屬殘留 |
應(yīng)不得超過10ppm |
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無(wú)菌 |
符合規(guī)定 |
GMP級(jí)產(chǎn)品生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)
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數(shù)據(jù)展示：
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高純度：SDS-PAGE&SEC-HPLC雙重驗(yàn)證，蛋白純度≥95%
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切割活性高：體外切割效率≥90%
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細(xì)胞編輯效率高
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將不同Cas/sgRNA RNP復(fù)合物通過電轉(zhuǎn)方式遞送至293T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，抽提基因組DNA，進(jìn)行體外切割測(cè)試。
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同條件下，近岸蛋白的Cas9蛋白體外切割效率優(yōu)于其他同類品牌。 |
近岸蛋白的Cas9蛋白在編輯效率和敲除得分上都優(yōu)于競(jìng)品。 |
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近岸蛋白基因編輯系列產(chǎn)品：
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目錄號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
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Recombinant Cas9 Nuclease, GMP Grade |
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NLS-Cas9 Nuclease |
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sgRNA In Vitro Transcription Kit |
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sgRNA Screening and Genotype Confirmation Kit |
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Cas9(D10A) Nickase |
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Cas9(H840A) Nickase |
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Cas9(D10A，H840A)Nuclease |
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LbaCas12a Nuclease |
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NLS-Cas9-EGFP Nuclease |
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LwaCas13a Nuclease |
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T7 Endonuclease I |
*小貼士：GMP級(jí)Cas9為醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)專用產(chǎn)品，表中無(wú)特別標(biāo)注GMP則為科研級(jí)產(chǎn)品。