中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院劉揚(yáng)和孫思予教授研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)研究表明脂滴形成在肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞對(duì)索拉非尼（sorafenib）的適應(yīng)性中至關(guān)重要，并利用基于質(zhì)譜的脂質(zhì)組和蛋白質(zhì)組揭示了其中重要的調(diào)控基因和作用機(jī)制。研究成果以“AKR1C3-dependent lipid droplet formation confers hepatocellular carcinoma cell adaptability to targeted therapy”為題，發(fā)表在Theranostics（IF：11.600）上。
研究結(jié)果
1.索拉非尼抗性的肝癌細(xì)胞中存在著脂肪酸氧化（FAO）向糖酵解轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的脂滴積累
研究者首先構(gòu)建了兩株索拉非尼抗性的肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞系，分別為HepG2R 和HuH7R。隨后，檢測(cè)了索拉非尼抗性癌細(xì)胞的耗氧率（OCR）和細(xì)胞外酸化率（ECAR）。結(jié)果顯示，抗性癌細(xì)胞的OCR下降，ECAR上升，ECAR/OCR的比率也顯著上升。糖酵解代謝流檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖酵解增強(qiáng)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，抗性癌細(xì)胞完全廢棄了脂肪酸氧化（FAO）。研究者進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)無(wú)法被線粒體正常代謝的脂肪酸是否儲(chǔ)存在脂滴中。結(jié)果顯示，在索拉非尼和瑞戈非尼（Regorafenib）存在時(shí)，HepG2R 和HuH7R細(xì)胞里均檢測(cè)到了清晰的脂滴。索拉非尼處理能增加原始癌細(xì)胞中線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而在抗性癌細(xì)胞中僅有少量ROS的產(chǎn)生。此外，在抗性癌細(xì)胞的線粒體周?chē)鷻z測(cè)到了明顯的脂滴積累，這表明脂肪酸（FA）轉(zhuǎn)化為了甘油三酯（TAG）進(jìn)行存儲(chǔ)。為了確定脂滴形成是否對(duì)索拉非尼抗性有關(guān)鍵作用，研究者這使用Triacsin C對(duì)酰基輔酶A合成酶進(jìn)行抑制進(jìn)而阻止脂滴形成，結(jié)果抑制了索拉非尼抗性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
2. 脂質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)AKR1C3是TAG聚集的調(diào)控因子
接下來(lái)，研究者對(duì)抗性癌細(xì)胞和原始癌細(xì)胞進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示TAG（甘油三酯）是在抗性癌細(xì)胞中上調(diào)最顯著的代謝物，此外，前列腺素（PG）在抗性癌細(xì)胞中也普遍上調(diào)。為了找到調(diào)控TAG聚集的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，研究者對(duì)抗性癌細(xì)胞和原始癌細(xì)胞分別進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，有5個(gè)蛋白，包括HSD17B5 （AKR1C3）、TYB10、MGST1、 FSCN1和ANXA2在抗性癌細(xì)胞中上調(diào)。已有報(bào)道表明，AKR1C3與多囊卵巢綜合征（PCOS）脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)形成相關(guān)，因此，研究者決定探究AKR1C3在肝細(xì)胞癌脂質(zhì)代謝中的作用。
WB證實(shí)了AKR1C3在抗性癌細(xì)胞中的高表達(dá)。在抗性癌細(xì)胞中還檢測(cè)到了脂肪酸合成酶（FASN）表達(dá)和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性的上升。研究者構(gòu)建了AKR1C3過(guò)表達(dá)的原始癌細(xì)胞HepG2-AKR1C3，并進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示HepG2-AKR1C3的脂質(zhì)組學(xué)特征與抗性癌細(xì)胞的脂質(zhì)組學(xué)特性相似，都有上升的甘油三酯（TAG）和前列腺素（PG）。此外，AKR1C3過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)p-ACC-s79和上調(diào)FASN的表達(dá)促進(jìn)了脂質(zhì)生成和脂滴產(chǎn)生，這與抗性癌細(xì)胞HepG2R中觀察到的現(xiàn)象一致。綜合以上結(jié)果表明，AKR1C3對(duì)脂滴形成有關(guān)鍵作用。
3. AKR1C3的缺失廢除TAG（甘油三酯）的積累并刺激FAO（脂肪酸氧化）
為了確定AKR1C3缺失是否影響肝細(xì)胞癌的脂質(zhì)積累，研究者利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除了抗性癌細(xì)胞HepG2R中的AKR1C3并進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，最明顯改變的代謝物富集在甘油磷脂代謝、甘油脂代謝和糖基磷脂酰肌醇（GPI）-錨定蛋白生物合成途徑。此外，AKR1C3的缺失明顯導(dǎo)致甘油三酯（TAG）的耗竭，以及二酰基甘油（DAG）、甘油磷脂（PC、LPC、PI、PS）和鞘磷脂（Cer、SM）種類(lèi)的上調(diào)。此外，與對(duì)照組相比，AKR1C3-/-HepG2R細(xì)胞中的線粒體β-氧化增強(qiáng)。在AKR1C3-/-細(xì)胞中也明顯觀察到線粒體膜電位和活性氧（ROS）生成的增加。總之，這些結(jié)果證明，AKR1C3的缺失抑制了細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TAG）的積累，促進(jìn)了脂肪酸運(yùn)輸?shù)骄€粒體進(jìn)行β-氧化。
4. AKR1C3依賴的脂滴形成阻止線粒體功能障礙和脂肪毒性
研究者假設(shè)AKR1C3通過(guò)抑制脂滴分解促進(jìn)脂滴形成。因?yàn)樵贏KR1C3-/-細(xì)胞中存在脂滴積累，于是研究者使用兩種AKR1C3的抑制劑，檢測(cè)當(dāng)AKR1C3活性被抑制后，是否會(huì)引起脂滴分解。研究者對(duì)AKR1C3抑制劑FLU（氟芬那酸）或5-βCA（5β-膽烷酸）處理后的抗性癌細(xì)胞HepG2R分別進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。結(jié)果與AKR1C3-/-細(xì)胞相一致，在索拉非尼存在的條件下，抑制AKR1C3顯著降低細(xì)胞甘油三酯（TAG）和脂滴的含量，而磷脂和鞘脂類(lèi)脂質(zhì)包括PE、PG、PI、PS和SM的含量則上升。同時(shí)還檢測(cè)到抑制AKR1C3能顯著降低甘油三酯（TAG）的減少以及細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸（FFA）的增加，提示線粒體中β-氧化作用的減弱。研究者對(duì)線粒體功能的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)抑制AKR1C3造成線粒體功能障礙。
5. AKR1C3抑制脂質(zhì)自噬以支持脂滴形成
接下來(lái)研究者探究AKR1C3是如何調(diào)控脂質(zhì)積累的。鑒于AKR1C3的基本功能是調(diào)控PG（前列腺素）合成，研究者首先檢測(cè)了PG代謝是如何促進(jìn)脂質(zhì)積累的。結(jié)果表明AKR1C3介導(dǎo)的索拉非尼抗性和脂滴積累是PG非依賴性的。
已有研究表明，抑制AKR1C3能增強(qiáng)胃腸癌細(xì)胞系中阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，因此研究者假設(shè)AKR1C3可能通過(guò)自噬介導(dǎo)的脂滴分解（脂質(zhì)自噬）調(diào)控脂滴穩(wěn)態(tài)。通過(guò)mCherry-GFP-LC3 融合蛋白實(shí)驗(yàn)表明，抑制AKR1C3能增強(qiáng)細(xì)胞自噬。加強(qiáng)細(xì)胞自噬能在AKR1C3抑制的條件下誘導(dǎo)更顯著的脂滴清除，而這種清除作用會(huì)被自噬抑制劑減弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在AKR1C3抑制劑和索拉非尼聯(lián)合處理?xiàng)l件下，自噬/脂質(zhì)自噬的抑制或者敲低ATG5都能顯著增強(qiáng)細(xì)胞生存，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞顯示出減少的細(xì)胞色素C釋放和活性氧（ROS）生成，并有脂滴的增加，且線粒體膜電位能恢復(fù)到正常區(qū)間。綜合以上結(jié)果表明，AKR1C3通過(guò)脂質(zhì)自噬調(diào)控脂滴穩(wěn)態(tài)。
6. AKR1C3促進(jìn)代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解
為了檢測(cè)AKR1C3是否會(huì)影響能量代謝，研究者對(duì)原始癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AKR1C3或在抗性癌細(xì)胞中敲低AKR1C3。過(guò)表達(dá)AKR1C3后，原始癌細(xì)胞的耗氧率（OCR）下降，細(xì)胞外酸化率（ECAR）上升，ECAR/OCR比值上調(diào)3.7倍。在抗性癌細(xì)胞中敲低AKR1C3后，耗氧率（OCR）上升，細(xì)胞外酸化率（ECAR）下降，，ECAR/OCR比值下降2倍。此外，過(guò)表達(dá)AKR1C3降低了AMPK-T172磷酸化、PPARα和CPT1A的水平，但增加了HK2的蛋白水平。而AKR1C3的抑制恢復(fù)了索拉非尼處理的癌細(xì)胞中上述蛋白的水平。此外，與對(duì)照細(xì)胞相比，高表達(dá)AKR1C3的HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出更大的生長(zhǎng)依賴性。相反，與對(duì)照組相比，AKR1C3-/- HepG2R細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性較低。最后，在索拉非尼處理?xiàng)l件下，AKR1C3過(guò)表達(dá)明顯提高了HepG2細(xì)胞的存活率，而敲除AKR1C3使HepG2R細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感。這些結(jié)果表明，AKR1C3使代謝從脂肪酸氧化轉(zhuǎn)向糖酵解，以促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的抗性。
7. AKR1C3維持索拉非尼處理?xiàng)l件下肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)
接下來(lái)，研究者探究了索拉非尼和FLU （氟芬那酸，AKR1C3抑制劑）聯(lián)合治療對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，聯(lián)合治療強(qiáng)烈地抑制了抗性癌細(xì)胞HepG2R和HuH7R異種移植瘤的生長(zhǎng)。免疫組化顯示CPT1A和PPARα的表達(dá)明顯升高，提示細(xì)胞存在脂滴分解。油紅染色實(shí)驗(yàn)證明，聯(lián)合治療降低了肝細(xì)胞癌細(xì)胞異種移植腫瘤中的脂滴積累。進(jìn)一步，研究者觀察了AKR1C3-/-HepG2R移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，AKR1C3缺失與索拉非尼協(xié)同作用，通過(guò)誘導(dǎo)脂肪吞噬來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。以上基于肝細(xì)胞癌細(xì)胞異種移植瘤模型的研究表明，抑制AKR1C3會(huì)誘導(dǎo)脂滴分解和線粒體脂質(zhì)毒性，從而使耐藥的肝細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感。
研究總結(jié)
本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的索拉非尼治療會(huì)損害脂肪酸氧化（FAO），導(dǎo)致肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞中脂滴（LD）的積累。對(duì)索拉非尼抗性和原始癌細(xì)胞的脂質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，醛酮還原酶AKR1C3是肝細(xì)胞癌中脂滴積累的重要調(diào)控基因。AKR1C3缺失完全消除脂滴含量，使游離脂肪酸流向磷脂、鞘脂和線粒體。此外，研究者發(fā)現(xiàn)AKR1C3依賴的脂滴積累是緩解索拉非尼誘導(dǎo)的線粒體脂肪毒性和功能障礙的必要條件。藥物抑制AKR1C3的活性會(huì)立即誘導(dǎo)自噬依賴的脂滴分解，導(dǎo)致線粒體裂變和索拉非尼抗性肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。改變AKR1C3的表達(dá)足以驅(qū)動(dòng)脂肪酸氧化和糖酵解之間的代謝轉(zhuǎn)換。AKR1C3可作為肝細(xì)胞癌治療的一個(gè)潛在靶標(biāo)。
吉?jiǎng)P基因憑借多年在靶標(biāo)篩選及驗(yàn)證服務(wù)領(lǐng)域的技術(shù)積累，建立的標(biāo)準(zhǔn)化 、工程化 、系統(tǒng)化的GRP平臺(tái)，為中國(guó)研究型醫(yī)生提供科研服務(wù)，加快科研成果轉(zhuǎn)化。其中，多組學(xué)平臺(tái)包含蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)和高通量測(cè)序平臺(tái)：
·蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)擁有多臺(tái)timsTOF Pro、Exploris 480高精度質(zhì)譜儀，專(zhuān)業(yè)的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專(zhuān)業(yè)的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質(zhì)組等檢測(cè)服務(wù)，強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務(wù)，系統(tǒng)的生物標(biāo)志物、分子分型、藥物靶點(diǎn)、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫(yī)生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測(cè)序平臺(tái)分為常規(guī)測(cè)序服務(wù)和單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)：單細(xì)胞測(cè)序擁有10x和BD兩個(gè)平臺(tái)，提供單細(xì)胞RNA-seq、單細(xì)胞核測(cè)序、單細(xì)胞混樣RNA-seq、單細(xì)胞TCR/BCR、單細(xì)胞（RNA+ATAC）、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等服務(wù)；常規(guī)測(cè)序服務(wù)提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測(cè)序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修飾測(cè)序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測(cè)序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（兩文庫(kù)/三文庫(kù)）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務(wù)。