近幾年，腸道微生物可以說(shuō)是最熱的研究熱點(diǎn)，頻繁登上在CNS期刊的封面，不僅相關(guān)主題的學(xué)術(shù)論文表現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)，而且國(guó)自然資助的腸道微生物項(xiàng)目數(shù)也呈顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其中2018年一共資助了近180項(xiàng)研究，資助金額高達(dá)7600萬(wàn)。由此可見(jiàn)腸道微生物一直是科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，相信2019年腸道微生物仍是國(guó)自然申請(qǐng)的熱點(diǎn)。總之，緊跟這個(gè)熱點(diǎn)，不僅容易發(fā)文、發(fā)好文，申請(qǐng)基金也更加容易。
現(xiàn)有常用研究策略的不足
16S測(cè)序或宏基因是最常用的腸道微生物研究手段，主要側(cè)重研究腸道微生物的多樣性與生理、疾病之間的相關(guān)性。盡管這樣的研究方法能夠有助于了解生物過(guò)程中的菌群遷移情況以及找出潛在的參與疾病發(fā)生的菌株，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步借助動(dòng)物模型采用糞便移植或者特定菌株的灌胃實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，可以相對(duì)直接地揭示腸道微生物或特定菌株與疾病之間的因果關(guān)系，但是對(duì)菌的功能與作用機(jī)制卻知之甚少，也就是說(shuō)僅僅采用16S測(cè)序或宏基因測(cè)序難以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌群功能的探究。因此，從國(guó)自然申請(qǐng)標(biāo)書(shū)的研究方案完整性與創(chuàng)新性上來(lái)看，這是需要大家關(guān)注的問(wèn)題。
腸道菌群功能研究的切入點(diǎn)
目前大量研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物對(duì)食物或外源性物質(zhì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一些小分子是有功能和活性的，如SCFAs，膽汁酸，TMA/TMAO，神經(jīng)遞質(zhì)，氨基酸等物質(zhì)對(duì)腸上皮組織乃至整個(gè)機(jī)體的物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。腸道菌群正是通過(guò)這些活性小分子與宿主進(jìn)行相互作用的。因此為了更好的理解腸道微生物-宿主之間的相互作用關(guān)系，不僅需要了解腸道菌群的多樣性變化，還需要進(jìn)一步研究腸道菌群功能的變化，即對(duì)腸道菌群代謝產(chǎn)物的變化進(jìn)行研究。所以如果從代謝物作為菌群功能研究的切入角度，相信會(huì)給申請(qǐng)國(guó)自然的項(xiàng)目的完整性、創(chuàng)新性加分不少。
打通多樣性+功能的研究策略——16S+代謝組
菌群的多樣性分析最常用的方法是采用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序方法（以下簡(jiǎn)稱(chēng)16S），其低成本快速高效，且方法成熟。而菌群功能則可以通過(guò)代謝組學(xué)對(duì)菌群相關(guān)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)性地檢測(cè)。代謝組學(xué)是基于高通量分析和生物信息學(xué)技術(shù)，一種用于研究?jī)?nèi)源性小分子的組學(xué)技術(shù)，能夠客觀地檢測(cè)菌群代謝產(chǎn)物，清晰的反映腸道菌群“功能”在特定條件下的變化。（如果前期沒(méi)有關(guān)注特別關(guān)注的代謝物，可以選擇非靶向代謝組學(xué)進(jìn)行大規(guī)模篩選，如果有特定關(guān)注的代謝物，則可以選擇靶向代謝組學(xué)。）16S與代謝組學(xué)相結(jié)合，打通腸道群菌“多樣性”與“功能”，是最具有生物學(xué)聯(lián)系的兩個(gè)層面的聯(lián)合，有助于全面探索腸道菌群與疾病發(fā)生、藥物代謝/藥效關(guān)系。
正是因?yàn)?6S+代謝能夠研究得更加深入和完整，所以近2年不少高水平文章都是采用這樣的研究套路，甚至還有不少文章僅是補(bǔ)了個(gè)代謝實(shí)驗(yàn)，拿以前16S的數(shù)據(jù)又再發(fā)表了一篇文章。
16S+代謝聯(lián)合分析的關(guān)鍵——代謝組學(xué)
16S+代謝聯(lián)合分析能否做得好，更關(guān)鍵的可能在代謝組實(shí)驗(yàn)。16S是基于測(cè)序技術(shù)，起步早，方法成熟，不同平臺(tái)的檢測(cè)能力、數(shù)據(jù)質(zhì)量相對(duì)接近，在這里不做過(guò)多討論。與16S 不同，代謝組學(xué)發(fā)展最晚，有一定特殊性，遠(yuǎn)比轉(zhuǎn)錄組、蛋白組更復(fù)雜，比如說(shuō)鑒定、質(zhì)量控制都存在很多難點(diǎn)。不同平臺(tái)的分析能力差異還是非常大的。
● 從鑒定來(lái)說(shuō)，代謝組無(wú)法像測(cè)序一樣做拼接，也無(wú)法像蛋白組一樣通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)直接解決鑒定問(wèn)題。代謝物存在大量的同分異構(gòu)體和分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，因此如果通過(guò)分子質(zhì)量去檢索公共數(shù)據(jù)庫(kù)往往會(huì)匹配到多個(gè)代謝物，這樣的結(jié)果毫無(wú)意義。那代謝物究竟是怎么去做鑒定的呢？當(dāng)儀器型號(hào)和參數(shù)固定了，代謝物碎裂形成的二級(jí)譜圖也就固定了，但可避免的也會(huì)出現(xiàn)碎裂圖譜相似的代謝物干擾匹配結(jié)果，所以一般還需要經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行人工二次確認(rèn)。正是因?yàn)榇x物有這樣的特點(diǎn)，目前代謝物的精確鑒定是非常依賴(lài)于本地標(biāo)品自建數(shù)據(jù)庫(kù)+人工二次確認(rèn)，也是決定不同分析平臺(tái)鑒定結(jié)果可靠性的重要判斷依據(jù)。
● 從質(zhì)控來(lái)說(shuō)，代謝個(gè)體化差異大，所以樣本數(shù)量比其他組學(xué)要求多，因此實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性是很關(guān)鍵的考察點(diǎn)，發(fā)文章也是需要展示質(zhì)控結(jié)果的，同樣的，在考量不同分析平臺(tái)的時(shí)候質(zhì)控也應(yīng)該是非常重要的一項(xiàng)內(nèi)容，不要忽視。
如何進(jìn)行16S+代謝組學(xué)的聯(lián)合分析
關(guān)聯(lián)分析是數(shù)據(jù)深入挖掘的一種方式，主要用來(lái)發(fā)現(xiàn)隱藏在數(shù)據(jù)集中的關(guān)聯(lián)性或相關(guān)性。目前16S+代謝組學(xué)的聯(lián)合分析分為三步：
第一步：分別對(duì)16S和代謝組的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選顯著性差異菌群與顯著性差異代謝物。
第二步：基于Spearman或Pearson統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法對(duì)顯著性差異菌群與顯著性差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算。相關(guān)性系數(shù)越大，表明對(duì)應(yīng)的菌與代謝物之間的相關(guān)性越強(qiáng)。
第三步：借助網(wǎng)絡(luò)圖、層次聚類(lèi)熱圖等可視化方法，從多個(gè)角度對(duì)相關(guān)性計(jì)算結(jié)果進(jìn)行展示和挖掘，篩選引起代謝變化的關(guān)鍵菌株。
總 結(jié)
綜上所述，16S+代謝的研究策略彌補(bǔ)了目前16S或宏基因?qū)δ苎芯康娜笔?，是最具生物學(xué)意義的兩個(gè)組學(xué)關(guān)聯(lián)，打通了菌群多樣性與功能，借助相關(guān)性分析，可以對(duì)關(guān)鍵菌株及其功能進(jìn)行挖掘，能夠把文章故事講的更深、更完整、更創(chuàng)新。代謝組學(xué)發(fā)展較晚，是聯(lián)合分析的關(guān)鍵，如果代謝組學(xué)數(shù)據(jù)質(zhì)量存在問(wèn)題是會(huì)影響聯(lián)合分析數(shù)據(jù)挖掘。
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中科新生命提供完整、創(chuàng)新的解決方案：
● 已打通多樣性到功能的完整解決方案（16S+代謝組）。
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