近期，廣州醫(yī)科大附屬第三醫(yī)院和美國得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心合作，利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了參與鐵死亡的一個關(guān)鍵膜蛋白HPCAL1，并深入研究了其作用機制及潛在的靶向治療可能性。研究成果以“Identification of HPCAL1 as a specific autophagy receptor involved in ferroptosis”為題，發(fā)表在Autophagy（IF：13.391）上。
研究結(jié)果
?1.?HPCAL1?對鐵死亡是必須的
鐵死亡表現(xiàn)為細胞器和細胞膜的脂質(zhì)過氧化，但關(guān)鍵的膜調(diào)控蛋白仍然未知。研究者使用鐵死亡激活劑RSL3（一種谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 的抑制劑，誘導(dǎo)鐵死亡）分別處理人纖維肉瘤細胞HT-1080和人非小細胞肺癌細胞Calu-1，隨后分離細胞膜組分并進行基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，以期尋找關(guān)鍵的鐵死亡膜調(diào)控蛋白。
細胞膜組分的蛋白質(zhì)組學(xué)共鑒定了752個膜蛋白，這些膜蛋白的通路富集分析顯示，三羧酸循環(huán)代謝是鐵死亡中最受影響的通路，與此前報道的線粒體三羧酸循環(huán)和脂質(zhì)代謝參與鐵死亡的報道相一致。
在鐵死亡激活劑RSL3處理后的HT-1080和Calu-1中有16個共有上調(diào)蛋白，包括MAGOH、SPTAN1、OSTM1、HPCAL1、CPT2、FKBP1A、EBNA1BP2、FBL、PRDX3、H1-3/HIST1H1D、ZYX、 UBE2M、ANXA7、EIF4G1、HNRNPUL1和PRKAR1A。隨后，研究者在兩輪實驗中分別使用靶向這些16個蛋白基因的siRNA處理HT-1080和Calu-1細胞，最終僅有HPCAL1 siRNA能同時降低RSL3誘導(dǎo)的細胞死亡。因此，研究者鎖定HPCAL1進行后續(xù)探索。
為了進一步確認HPCAL1在促進鐵死亡中的作用，研究者構(gòu)建了能穩(wěn)定敲低HPCAL1的兩個特異性shRNA。與HPCAL1 siRNA實驗結(jié)果一致，HPCAL1 shRNA抑制了RSL3或erastin（另一種鐵死亡誘導(dǎo)劑）誘導(dǎo)的HT-1080和Calu-1細胞生長抑制。
隨后的研究也表明，HPCAL1缺失不影響細胞膜的完整性。此外，HPCAL1缺失將顯著降低脂質(zhì)過氧化，因此HPCAL1可能是鐵死亡中脂質(zhì)過氧化的正調(diào)節(jié)劑。研究者繼續(xù)使用其他鐵死亡誘導(dǎo)劑，包括ML162、ML210、FIN56、FINO2和sulfasalazine處理HT-1080和Calu-1細胞，結(jié)果均證實了HPCAL1的促鐵死亡作用。而形成鮮明對比的是，細胞凋亡誘導(dǎo)劑staurosporine (STS)導(dǎo)致的細胞死亡并不受到HPCAL1敲低的影響。這一結(jié)果表明，HPCAL1是選擇性促進鐵死亡而非細胞凋亡。
研究者隨后對HPCAL1進行過表達，過表達后細胞對鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3或erastin的處理更加敏感。此外，在HPCAL1敲低的細胞中重新穩(wěn)定過表達HPCAL1后，細胞恢復(fù)了對RSL3或erastin處理的敏感性,這種作用會被鐵死亡抑制劑liproxstatin-1抑制，而不受細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK的影響。
HPCAL1最開始是在視網(wǎng)膜和腦組織中被檢測到的，而該蛋白其實廣泛表達于各種組織和細胞中。研究者在其他種類的人癌細胞系中使用shRNA敲低HPCAL1，結(jié)果顯示HPCAL1敲低均可以抑制RSL3或erastin誘導(dǎo)的細胞死亡。綜合以上研究表明，HPCAL1介導(dǎo)廣泛的鐵死亡。
?2.?HPCAL1介導(dǎo)的CDH2抑制能促進鐵死亡
研究者進一步探索了HPCAL1促進鐵死亡的作用機制。首先，研究者通過實驗排除了鈣離子參與HPCAL1介導(dǎo)的鐵死亡以及HPCAL1在鐵死亡中催化脂質(zhì)通透性/氧化。隨后，研究者檢測HPCAL1是否與鐵死亡相關(guān)蛋白結(jié)合。通過HPCAL1的CO-IP MS實驗，共發(fā)現(xiàn)在RSL3處理和未處理的HT-1080和Calu-1細胞中，與HPCAL1結(jié)合的蛋白有600多個。GO功能富集分析顯示粘著斑和細胞-底物接合是最顯著富集的條目。
研究者關(guān)注其中一個在RSL3處理后與HPCAL1結(jié)合變化倍數(shù)最大的蛋白CDH2。隨后，研究者分別用RSL3（鐵死亡激活劑）和STS（細胞凋亡誘導(dǎo)劑）處理細胞，并進行CDH2的CO-IP。結(jié)果表明，在鐵死亡狀態(tài)下而非細胞凋亡狀態(tài)下，CDH2與HPCAL1的結(jié)合加強。該結(jié)果顯示了HPACAL1-CDH2復(fù)合體在鐵死亡中的特殊作用。
接下來的研究顯示，當(dāng)CDH2被敲低后，能恢復(fù)HPCAL1敲低細胞對RSL3或erastin的敏感性，而這種作用可以被鐵死亡抑制劑DFO而非細胞凋亡抑制劑Z-VAD-FMK逆轉(zhuǎn)。而在HPCAL1過表達的細胞中繼續(xù)過表達CDH2則會限制RSL3或erastin的細胞殺傷活性。綜合以上結(jié)果表明，HPCAL1通過劫持抗鐵死亡CDH2蛋白來促進鐵死亡。
?3.?HPCAL1介導(dǎo)CDH2降解
緊接著研究者探究HPCAL1-CDH2復(fù)合體的形成是如何抑制CDH2的抗鐵死亡作用。首先發(fā)現(xiàn)，在RSL3或erastin處理后，細胞中的CDH2蛋白表達顯著下調(diào)，而細胞凋亡誘導(dǎo)劑STS則不影響CDH2的表達。研究者隨后明確，CDH2的降解是鐵死亡過程中的自噬介導(dǎo)的，在鐵死亡過程中自噬流增強。
自噬受體一般會將吞噬泡和自噬小體上的MAP1LC3B-II和要降解的目標分子進行連接，因此研究者檢測了HPCAL1和MAP1LC3B-II的膜脂質(zhì)定位。WB顯示在RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡條件下，細胞膜組分中的HPCAL1和MAP1LC3B-II表達量均上升。HPCAL1可以與磷脂酰肌醇結(jié)合，這與此前報道的磷脂酰肌醇是自噬小體形成和成熟中關(guān)鍵的協(xié)調(diào)分子相一致。此外，CO-IP實驗也證實，在RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡條件下，膜組分存在HPCAL1、CDH2和MAP1LC3B-II的結(jié)合。
下一步，研究者的實驗表明：（1）在鐵死亡中HPCAL1選擇性地介導(dǎo)CDH2蛋白的自噬降解。（2）HPCAL1上預(yù)測到的兩個LIR（LC3互作區(qū)）motif ：DEFFKKI (aa 46-51) 和AIYKMV (aa 127-132)。HPCAL1突變實驗表明， Δ127-132缺失不影響HPCAL1與LC3的結(jié)合，而Δ46-51缺失則影響HPCAL1與LC3的結(jié)合。此外，Δ46-51缺失抑制RSL3或erastin誘導(dǎo)的CDH2降解。
?4.?PRKCQ介導(dǎo)的HPCAL1磷酸化促進CDH2的降解
研究者繼續(xù)探索了HPCAL1磷酸化是否以及如何調(diào)控鐵死亡中的CDH2降解。研究者通過實驗初步確認PRKC（蛋白激酶C）的底物選擇性參與鐵死亡相關(guān)的自噬。隨后，研究者明確HPCAL1是PRKC的潛在底物。生信預(yù)測顯示，PRKC可能磷酸化HPCAL1 149位蘇氨酸（Thr）的磷酸化。功能實驗表明，過表達野生型HPCAL1（Thr149）增強CDH2降解，而過表達磷酸化突變（T149A，149位蘇氨酸突變?yōu)楸彼幔﹦t較少CDH2的降解。兩個PRKC抑制劑則抑制RSL3或erastin誘導(dǎo)的鐵死亡。以上結(jié)果表明，PRKC依賴的HPCAL1磷酸化介導(dǎo)了鐵死亡中CDH2的降解。此外，研究者的實驗表明，是PRKC家族中的PRKCQ Thr538的磷酸化使的PRKCQ激活，參與了鐵死亡。
接下來，研究者檢測了PRKCQ在鐵死亡中的作用。結(jié)果表明，鐵死亡激活劑RSL3而非凋亡誘導(dǎo)劑STS能增強PRKCQ和HPCAL1的結(jié)合。PRKCQ敲低限制了RSL3或erastin誘導(dǎo)的癌細胞生長抑制。PRKCQ敲低保護細胞免受細胞死亡、脂質(zhì)過氧化和CDH2的自噬降解。此外，在細胞缺失HPCAL1和CDH2的情況下，敲低PRKCQ不影響細胞對鐵死亡敏感性。這表明，PRKCQ是鐵死亡的上游信號。
?5.?鑒定HPCAL1抑制劑（iHPCAL1）可作為鐵死亡的抑制劑
研究者從4208個無明確靶點的小分子中篩選新的HPCAL1抑制劑。實驗發(fā)現(xiàn)，有157個化合物能抑制RSL3誘導(dǎo)的細胞死亡。接下來，研究者檢測這157個化合物中哪些可以降低HPCAL1的蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，#5和#155號化合物可以顯著抑制HPCAL1蛋白表達。隨后，研究者關(guān)注既不是抗氧化劑也無鐵螯合劑活性的#5號化合物，并將之命名為iHPCAL1。分子對接實驗（molecular docking assay）顯示iHPCAL1可以與HPCAL1結(jié)合。
細胞熱遷移分析（cellular thermal shift assay）證實iHPCAL1延緩熱誘導(dǎo)的HPCAL1蛋白降解，表明iHPCAL1直接與HPCAL1相互作用。功能分析表明iHPCAL1不能影響PRKCQ的磷酸化，但可以抑制HPCAL1的磷酸化以及RSL3或erastin誘導(dǎo)的CDH2的自噬降解。這些結(jié)果表明，iHPCAL1誘導(dǎo)的HPCAL1磷酸化和功能的抑制發(fā)生在PRKCQ 磷酸化的下游。隨后的研究表明硼替佐米（泛素-蛋白酶體抑制劑），而不是氯喹（自噬抑制劑），可以阻止iHPCAL1誘導(dǎo)的HPCAL1蛋白降解。這些結(jié)果表明iHPCAL1通過蛋白酶體途徑刺激HPCAL1的降解，從而限制了鐵死亡。
?6.?體內(nèi)實驗檢測HPCAL1介導(dǎo)的鐵死亡響應(yīng)
Imidazole ketone erastin (IKE)是一種具有更好效力和代謝穩(wěn)定性的erastin類似物，適用于在動物研究評估鐵死亡對腫瘤抑制的影響。研究者構(gòu)建了HPCAL1敲低的HT-1080癌細胞異種移植瘤裸鼠模型，并發(fā)現(xiàn)敲低HPCAL1限制了IKE的腫瘤抑制作用。HPCAL1敲低組與對照組相比，CDH2蛋白水平升高，而MAP1LC3B-II降低。鐵死亡生物標志物的定量結(jié)果以及血清中HMGB1的濃度進一步支持HPCAL1促進了IKE誘導(dǎo)的體內(nèi)鐵死亡的假設(shè)。同樣地，iHPCAL1在異種移植瘤模型中抑制IKE的抗癌活性，而對IKE誘導(dǎo)的GPX4降解無顯著影響。這些動物體內(nèi)研究與體外研究一致，表明HPCAL1是鐵死亡的正調(diào)節(jié)因子。
隨后，研究者利用蛙皮素（cerulein）誘導(dǎo)胰腺條件性敲除GPX4的小鼠發(fā)生急性胰腺炎，并檢測iHPCAL1是否有保護作用。結(jié)果顯示，iHPCAL1能很好地改善急性胰腺炎中的各項生化指標，具有顯著的保護作用。與預(yù)期一致，在使用iHPCAL1后，HPCAL1蛋白水平下調(diào)。綜合以上結(jié)果表明，HPCAL1參與了鐵死亡誘導(dǎo)的急性胰腺炎。
研究總結(jié)
研究者利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到了一個參與鐵死亡的膜蛋白HPCAL1。HPCAL1作為一種特異性自噬受體，在鐵死亡過程中選擇性降解CDH2(鈣粘蛋白2)。CDH2耗竭又進一步通過降低膜張力和促進脂質(zhì)過氧化而增加鐵死亡的易感性。深入的機制研究發(fā)現(xiàn)，CDH2的自噬降解需要PRKCQ(蛋白激酶C theta)介導(dǎo)的HPCAL1在Thr149上的磷酸化，以及位于46-51位氨基酸之間的非經(jīng)典LC3互作區(qū)域motif。最后，研究者從4208個小分子化合物的藥物篩選中確定了一種抑制HPCAL1表達的鐵死亡抑制劑。在小鼠模型中，HPCAL1的抑制阻止了鐵死亡誘導(dǎo)的腫瘤抑制和胰腺炎。研究者的發(fā)現(xiàn)為自噬依賴細胞死亡的機制提供了見解，并為靶向HPCAL1以預(yù)防致病性鐵死亡提供了可能性。
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