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新冠病毒核酸檢測原理

作者:河北品科研生物科技有限公司 2022-06-30T10:41 (訪問量:59322)

mportant; overflow-wrap: break-word !important;">假陰性,就是指被檢測者已經(jīng)感染了新冠病毒,但是卻沒有檢測出病毒核酸,即核酸檢測為陰性。出現(xiàn)假陰性的原因主要有以下三方面:

第一,原始檢測標(biāo)本中新冠病毒核酸含量過低,低于能被檢測到的下限。這與所采集樣本的類型和采集的時(shí)機(jī)等都有關(guān)系。

第二,如果新冠病毒核酸與探針結(jié)合的部位發(fā)生變異,可能影響檢測中探針的結(jié)合效率,導(dǎo)致熒光信號(hào)檢測不到。

第三,假陰性也和檢測技術(shù)的靈敏度有關(guān)。

假陽性,是指因?yàn)榉N種原因把不是陽性的人檢測出陽性的結(jié)果。

造成PCR假陽性問題的因素相對單一, 由于PCR的敏感性和效率特別高, 只要有少的擴(kuò)增產(chǎn)物將標(biāo)本或反應(yīng)管污染即可出現(xiàn)假陽性, PCR儀器的性能差異和溫控不準(zhǔn)等質(zhì)量問題造成非特異性擴(kuò)增也會(huì)導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象。

如果樣本采集和PCR試劑配制及反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過程中, 引物設(shè)計(jì)不合理, 選擇的擴(kuò)增列序與非目的性擴(kuò)增列序具有同源性, 檢測樣品出現(xiàn)交叉污染、PCR試劑污染或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、氣溶膠污染以及實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒污染都會(huì)造成假陽性現(xiàn)象出現(xiàn)。

06

遺傳物質(zhì)DNARNA

我們常說的遺傳物質(zhì),一般是指DNA,但對于病毒而言,RNA則是它的遺傳物質(zhì)。

對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)來講,只要有DNA的地方,DNA具有支配作用。而此時(shí)的RNA,也受DNA指揮。比如,當(dāng)我們的細(xì)胞需要合成蛋白質(zhì)時(shí),位于細(xì)胞核的某個(gè)DN**段就會(huì)打開,然后在酶的作用下,合成信使RNA(mRNA),信使RNA則回頭可以在核糖體處,合成肽鏈。在這個(gè)過程中,我們看到了遺傳信息由DNA到RNA的過程,我們稱其為遺傳信息轉(zhuǎn)錄,該過程簡稱轉(zhuǎn)錄。


而對于病毒而言,它們比較特殊,很多病毒都以RNA為自己的遺傳物質(zhì)。這是因?yàn)樗鼈兦秩爰?xì)胞之后,可以將自己的RNA釋放其中,最后轉(zhuǎn)錄出病毒DNA。因?yàn)樵撨^程是由遺傳信息是由RNA到DNA的過程,所以稱為逆轉(zhuǎn)錄。


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新冠病毒核酸檢測原理

核酸檢測其實(shí)是檢測受測者體內(nèi)是否有新冠病毒的核酸(RNA)。每種病毒的核酸內(nèi)部都含有核糖核苷酸,不同的病毒所含的核糖核苷酸數(shù)量和排列順序不同,使得每種病毒都具有特異性。新冠病毒的核酸也是獨(dú)特的,核酸檢測就是對新冠病毒的核酸進(jìn)行特異性檢測。

01

新冠病毒核酸檢測一般流程

1.由醫(yī)護(hù)人員穿戴防護(hù)服,收集位于病人鼻咽部的液體。

2.在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對可能存在的病毒樣液進(jìn)行滅活處理,并提取樣本的核酸(這里面病毒只占很小一部分)。

3.對該樣本核酸進(jìn)行PCR技術(shù)擴(kuò)增。

4.將可與病毒信息匹配的熒光染料或熒光探針放入其中。

5.通過熒光強(qiáng)度,再結(jié)合對照組情況,綜合判斷是否存在新冠病毒。


02

前提:確定新冠病毒特異性特征

專業(yè)人員將該病毒提取出來后對病毒RNA進(jìn)行測序在該病毒身上尋找可以用來鑒別其特異性的片段。


03

準(zhǔn)備工作:采集受測者樣本

在進(jìn)行核酸檢測之前,需要采集受測者的痰液、咽拭子、肺泡灌洗液、血液等樣本,對這些樣本進(jìn)行檢測,就可以發(fā)現(xiàn)受測者的呼吸道感染了什么病菌。新冠病毒核酸檢測常用的是咽拭子樣本檢測,將樣本裂解提純,從中提取出可能存在的新冠病毒核酸,檢測的準(zhǔn)備工作就做好了。


04

關(guān)鍵技術(shù)熒光定量RT-PCR

新冠病毒直徑只有60-140納米,一般細(xì)胞的直徑在10-20微米,而頭發(fā)絲的直徑在60-90微米。如果將細(xì)胞比作可以容納萬人的足球場,而病毒則好比里面的某個(gè)小座位一般不起眼。要想在如此小的尺度上分離出病毒,首先就是非常困難的事情,更別提如何去識(shí)別新冠病毒與其他病毒的差別。目前人們所使用的新冠病毒核酸檢測技術(shù),主要是一種叫做實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 的技術(shù)。


PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN**段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液,只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,就能用PCR加以放大,進(jìn)行比對。同理,痕量的病毒感染,其核酸也可以被捕捉到。該技術(shù)由1983年美國Mullis首先提出設(shè)想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡易DNA擴(kuò)增法,意味著PCR技術(shù)的真正誕生。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù):實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是PCR技術(shù)的拓展,所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。


熒光定量RT-PCR技術(shù)是熒光定量PCR技術(shù)與RT-PCR技術(shù)的結(jié)合。

在檢測過程中,先采用RT-PCR技術(shù)將新冠病毒的核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄為對應(yīng)的脫氧核糖核酸(DNA);再采用熒光定量PCR技術(shù),將得到的DNA進(jìn)行大量復(fù)制,同時(shí),使用特異性探針對復(fù)制得到的DNA進(jìn)行檢測,打上標(biāo)記。如果存在新冠病毒核酸,儀器就可以檢測到熒光信號(hào),而且,隨著DNA的不斷復(fù)制,熒光信號(hào)不斷增強(qiáng),這樣就間接檢測到了新冠病毒的存在。



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