確保外源基因在細(xì)胞或者動物體內(nèi)，持續(xù)和高水平的表達(dá)具有廣泛的應(yīng)用需求及科研價(jià)值。當(dāng)前遞送外源基因的生物學(xué)手段，主要是運(yùn)用質(zhì)粒或者病毒作為媒介表達(dá)基因，而啟動子是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的基礎(chǔ)元件。但是，經(jīng)常有老師反饋，為什么基因表達(dá)不強(qiáng)呢？為什么細(xì)胞傳代幾次之后就不表達(dá)了呢？今天，小編帶您盤點(diǎn)下，常用的組成型啟動子表達(dá)效率與細(xì)胞的關(guān)系。
啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游的一段可以行使轉(zhuǎn)錄起始功能的序列，結(jié)構(gòu)如下：
根據(jù)其對α-鵝膏蕈堿的敏感性不同，分為三類，常用的啟動子是Ⅱ、Ⅲ兩種啟動子。其中，Ⅲ型啟動子主要表達(dá)非編碼的短序列RNA，比如shRNA、miRNA等，我們常說的啟動子，或者細(xì)胞里面常規(guī)基因的啟動子，幾乎都是Ⅱ型啟動子，其特點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度不限，編碼與否不限等特點(diǎn)。
酶的種類1 | 存在 | 功能 | 對抑制物的敏感性 |
RNA聚合酶I | 核仁 | 合成rRNA前體 | 不敏感 |
RNA聚合酶II | 核質(zhì) | 合成mRNA前體及大多數(shù)snRNA | 敏感 |
RNA聚合酶III | 核質(zhì) | 合成5S rRNA前體、tRNA前體及其他的核和胞質(zhì)小RNA前體 | 存在物種特異性 |
Ⅱ型啟動子在使用特點(diǎn)上又可分為三大類：組成型啟動子、特異性啟動子、誘導(dǎo)啟動子。特異性啟動子只能在特定細(xì)胞表達(dá)，因此適合動物實(shí)驗(yàn)使用；誘導(dǎo)啟動子需要加入特定的藥物才能激發(fā)或者抑制其活性，如四環(huán)素誘導(dǎo)TRE表達(dá)；而表達(dá)系統(tǒng)中，運(yùn)用最多的則是組成型啟動子，這類啟動子在絕大部分細(xì)胞里面都能維持一定的表達(dá)活性，當(dāng)然，不同的啟動子也有高低表達(dá)之分。
載體上最常見的組成型啟動子包含：β-肌動蛋白啟動子（ACTB），巨細(xì)胞病毒（CMV），延伸因子-1α（EF1α），磷酸甘油酸激酶（PGK）、泛素C（UbC、本文別名FCIV），具有CMV最大內(nèi)含子的CMV啟動子/增強(qiáng)子（CMVi啟動子）、巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子和雞β-肌動蛋白啟動子組成的CAG，猿猴病毒來源的SV40等。其中，最常見的是CMV啟動子，在大量的商業(yè)化載體上如pcDNA3、pEGFP使用，病毒上最常見啟動子是CMV、EF1α，說明這些都是高表達(dá)啟動子，那么所有細(xì)胞系都合適嗎？小編收羅了不同文獻(xiàn)、不同細(xì)胞類型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，接著往下看：
混合細(xì)胞系
作者選了多種來源的細(xì)胞，包含成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、高度分化的肌肉細(xì)胞等，使用六個哺乳動物組成型啟動子，每個都插入GFP包裝成慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀對GFP強(qiáng)度進(jìn)行定量：
小鼠尾巴成纖維細(xì)胞（129TF），小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF），小鼠成肌細(xì)胞（C2C12），大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC），人成纖維細(xì)胞（MRC5），人纖維肉瘤細(xì)胞（HT1080），人胚胎腎細(xì)胞（293T）和恒河猴獼猴乳腺腫瘤細(xì)胞（CMMT）
結(jié)果表明：UBC跟PGK始終是弱的，SV40相對較強(qiáng)，EF1A和CAG啟動子在所有細(xì)胞類型中均具有較強(qiáng)的一致性，CMV啟動子是最多變的，是在一些細(xì)胞類型（很強(qiáng)烈例如，293T和CMMT）和其他（較弱例如，MRC5和MSC）。
由此看出，CMV在腫瘤細(xì)胞系傾向高表達(dá)，而EF1A和CAG在大部分細(xì)胞表達(dá)趨于穩(wěn)定，且這三個高強(qiáng)度啟動子在干細(xì)胞等類型活性都有所下降。所以，針對常規(guī)的腫瘤細(xì)胞系，常規(guī)體細(xì)胞系，三個啟動子的效果還是不錯的，但由干細(xì)胞表達(dá)效果差，推導(dǎo)出非常規(guī)的細(xì)胞系，如懸浮細(xì)胞系、神經(jīng)細(xì)胞等，啟動子如何選擇呢？
胚胎干細(xì)胞（hESCs）
干細(xì)胞相對復(fù)雜，因?yàn)檫€存在分化過程的干細(xì)胞，那么干細(xì)胞對于啟動子的選擇有何特點(diǎn)呢？
對hESCs中ACTB，CMV，EF1α，PGK和UbC啟動子的活性進(jìn)行了比較研究。選擇慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移作為基因傳遞系統(tǒng)，通過FACS分選出了eGFP +細(xì)胞,結(jié)果如下：
1.未分化的hESCs的啟動子活性
在FACS分選后的15、30和50天測量啟動子活性，通過OCT3 / 4，NANOG和hES-Cellect（Cellartis AB）多能蛋白的標(biāo)記證實(shí)了eGFP +細(xì)胞的多能性：
第0天，所有啟動子的eGFP+百分比約為98％，第30天，ACTB，EF1α和PGK的啟動子活性均相等，第50天，CMV-eGFP+細(xì)胞的百分比降低于10％，EF1α也出現(xiàn)下降。
2. 分化的hESCs中的啟動子活性
慢病毒介導(dǎo)GFP的將hESC系SA121，在第0天（d0），未分化狀態(tài)第22天（undiff），分化為胚狀體22天（EB），測試GFP +細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，啟動子在分化過程中被顯著下調(diào)，并且在大約50％的分化細(xì)胞中沒有活性。EF1α是分化過程中最穩(wěn)定的啟動子；CMV啟動子僅在細(xì)胞的一小部分（約15％）具有活性。
總之，就長期保持未分化的hESCs的轉(zhuǎn)基因（eGFP）表達(dá)而言，ACTB，EF1α和PGK啟動子是最穩(wěn)定的啟動子；而在分化過程中，成型啟動子的活性會下降，相對而言，EF1α啟動子具有最高的穩(wěn)定性。原因即細(xì)胞在分化過程中，所表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子是有差異的，部分啟動子表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄因子丟失，同時(shí)染色體結(jié)構(gòu)的改變影響了外源插入序列的狀態(tài)，導(dǎo)致啟動子出現(xiàn)沉默現(xiàn)象。
造血干細(xì)胞（HSC）/祖細(xì)胞
造血干細(xì)胞（HSC）具有自我更新和多譜系分化成所有成熟血細(xì)胞的潛力。因此，有效轉(zhuǎn)導(dǎo)至HSCs將提供治療因血細(xì)胞功能異常而導(dǎo)致的多種疾病的機(jī)會，并且將成為研究HSCs增殖，分化和運(yùn)輸調(diào)節(jié)的有力工具。作者構(gòu)建了攜帶多個啟動子表達(dá)熒光的腺病毒，感染兩種狀態(tài)的造血細(xì)胞，以流式檢測：
成熟CD34+ 成熟CD34+
免疫細(xì)胞
結(jié)果顯示：當(dāng)用于造血細(xì)胞中時(shí)，CMV啟動子傾向于沉默。轉(zhuǎn)基因可能以非常低的水平表達(dá)或無法檢測。EF1α、CMVi和CAG啟動子在轉(zhuǎn)導(dǎo)人骨髓CD34+細(xì)胞方面表現(xiàn)優(yōu)異。特別地，CAG啟動子在CD34+細(xì)胞和未成熟的CD34+亞群中最有效地發(fā)揮作用。
當(dāng)前，以CAR-T和TCR-T為代表的細(xì)胞治療非常火熱，前者都需要運(yùn)用慢病毒感染T細(xì)胞。免疫類細(xì)胞，諸如T細(xì)胞，病毒感染難度較大，啟動子的選擇得注意。
作者構(gòu)建多個啟動子的慢病毒載體表達(dá)熒光，感染經(jīng)過IL-2刺激過的PBL細(xì)胞，以FACS檢測，觀察到CMV啟動子在原代T細(xì)胞驅(qū)動效率低，CAG也相對較差，其余幾個啟動子的效率相近，都在60%上下。
進(jìn)一步以以抗CD3抗體OKT3刺激細(xì)胞，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，活化后的T細(xì)胞，多個啟動子的表達(dá)效率得到增強(qiáng)，其中以MSCV啟動子最優(yōu)。
在PBL中，發(fā)現(xiàn)含有MSCV啟動子的載體最適合，在最低程度刺激的淋巴細(xì)胞和高度活化的淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。當(dāng)然，文章沒有比較EF1α，實(shí)際后者在T細(xì)胞也有不俗的表達(dá)水平。
神經(jīng)細(xì)胞
用CMV-GFP，PGK-GFP，MND-GFP和泛素C啟動子（FCIV）轉(zhuǎn)導(dǎo)了含有神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的小鼠新皮層培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)導(dǎo)后四天，我們對神經(jīng)元（NeuN陽性）進(jìn)行檢測，在FCIV轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中85％的神經(jīng)元表達(dá)了GFP，PGK為55.2％，且大多數(shù)報(bào)告基因陽性細(xì)胞與NeuN共定位；而CMV為4.1％、MND為0.7％。且?guī)缀跖cNeuN染色的細(xì)胞不重疊，說明后兩者不適合神經(jīng)元的表達(dá)。
以上述病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來自SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，結(jié)果顯示：CMV，PGK和FCIV在未分化和分化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中均具有活性，但CMV啟動子活性最高，尤其是在分化后（小腦顆粒神經(jīng)元顯示出相同的結(jié)果，數(shù)據(jù)見原文）。
對于涉及原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)的研究，UBC和PGK啟動子可能是基因表達(dá)的最佳選擇。UBC，PGK，CMV和MND啟動子均適用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。在小腦顆粒細(xì)胞和分化的SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤培養(yǎng)物中，CMV啟動子指導(dǎo)最穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
總結(jié)
通過本文一系列細(xì)胞及使用啟動子的使用情況的整理，我們可以得出如下結(jié)論：
1.CMV啟動子作為最為廣泛使用的啟動子，適合在腫瘤細(xì)胞、肌肉、肝臟等體細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞的表達(dá)，而不適合大多數(shù)干細(xì)胞、懸浮細(xì)胞及原代細(xì)胞的表達(dá)；
2.EF1α啟動子適合干細(xì)胞、原代細(xì)胞、造血細(xì)胞等的表達(dá)，在常用細(xì)胞如HEK293、腫瘤等細(xì)胞系中弱與CMV；
3.部分細(xì)胞在傳代過程中，外源啟動子會出現(xiàn)沉默現(xiàn)象，不同的啟動子沉默效率有所差異，對于少見的細(xì)胞系，或者會分化的細(xì)胞系，研究者需要考慮啟動子的選擇，或者多做些分組；
4.CAG啟動子在不少細(xì)胞系，諸如免疫細(xì)胞、體細(xì)胞，有不次于CMV的表達(dá)效率，也是基因表達(dá)的一個較優(yōu)選擇的啟動子。
實(shí)際上，常用于表達(dá)外源基因的啟動子主語局限于CMV、EF1α、CAG、UBC等，本文涉及的PGK、SV40等主要用于表達(dá)熒光、抗性等，很多載體出現(xiàn)熒光弱等問題，可以看看表達(dá)熒光用的何種啟動子。當(dāng)然，諸如懸浮細(xì)胞還可以使用SFFV等啟動子實(shí)現(xiàn)高表達(dá)（可參考吉凱基因懸浮病毒載體使用手冊）。總之，啟動子的選擇對于基因的表達(dá)至關(guān)重要，吉凱也開發(fā)了更加高效表達(dá)的啟動子系列，對于基因表達(dá)弱，熒光弱的老師們，快來吉凱咨詢吧！！！
【參考文獻(xiàn)】
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