此前的研究中，團(tuán)隊(duì)以小鼠原代肝細(xì)胞衍生的HepOrg為起點(diǎn)，通過(guò)在培養(yǎng)基中補(bǔ)充Wnt3A或Wnt替代物，將類器官的形成效率提升了2-3倍，并實(shí)現(xiàn)了體外長(zhǎng)期維持。不過(guò)，優(yōu)化后的HepOrg中仍然存在部分未嵌入肝細(xì)胞或與肝細(xì)胞形成生理連接的膽管細(xì)胞類器官，因此研究人員進(jìn)一步更替了培養(yǎng)基，使用此前共培養(yǎng)膽管與門管間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基（MM），發(fā)現(xiàn)獲得的類器官中不僅肝細(xì)胞功能更為成熟、且門管周圍基因表達(dá)水平也有所提升。該MM培養(yǎng)基同樣也添加了Wnt3A作為支持。

接下來(lái)的目標(biāo)是完全重建肝小葉門管區(qū)。研究人員利用搖動(dòng)平臺(tái)，將優(yōu)化后的HepOrg與膽管類器官、門周間充質(zhì)細(xì)胞按精確比例混合。這一過(guò)程的成功率高達(dá)90%，獲得的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)即為“組合體”。該模型在中觀尺度上精準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)了天然組織布局：具有開放管腔的膽管被門管間充質(zhì)細(xì)胞包圍，并嵌入在肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)中。

圖：組裝體復(fù)刻了小鼠原代組織的結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)試圖將培養(yǎng)方案移植到人源類器官中。同樣遵循循序漸進(jìn)的思路，先培養(yǎng)可長(zhǎng)期擴(kuò)增的人類肝細(xì)胞類器官（h-HepOrgs），而后再嘗試與膽管類器官、門管區(qū)間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行三位一體的組裝。

長(zhǎng)期以來(lái)，原代人類肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)中極易失去表型并迅速死亡，這嚴(yán)重限制了其在疾病建模中的應(yīng)用。本研究首先通過(guò)兩步膠原酶灌注法從患者肝組織中獲取細(xì)胞。在篩選培養(yǎng)基的過(guò)程中，研究人員通過(guò)分析肝癌類器官和部分肝切除后再生組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，識(shí)別出WNT和YAP信號(hào)通路是促進(jìn)肝細(xì)胞退出靜止期并進(jìn)入增殖狀態(tài)的關(guān)鍵。因此，類似于小鼠HepOrgs培養(yǎng)方案，Wnt3A 或 Wnt 替代物同樣是h-HepOrgs培養(yǎng)基中的“標(biāo)配”。

通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加WNT替代物（WntS）和LATS1/2抑制劑（TRULI），研究團(tuán)隊(duì)成功誘導(dǎo)了肝細(xì)胞類器官的形成。更具突破性的是，研究人員發(fā)現(xiàn)移除培養(yǎng)基中的煙酰胺能使類器官的形成效率顯著提升近10倍。此外，與小鼠培養(yǎng)方案不同的是，由于人類肝細(xì)胞在體外極易去分化，為了維持其表型，人類方案通常需要更復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)組合，包括特定的人類重組生長(zhǎng)因子（如 HGF、hEGF、FGF10、FGF7）以及針對(duì)性的小分子抑制劑（如 TGF-β 抑制劑A83-01)），以防止細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生纖維化或轉(zhuǎn)化為無(wú)功能的成纖維細(xì)胞。

由于人類的膽汁代謝路徑更復(fù)雜。為了確保人類組合體能夠?qū)崿F(xiàn)“膽汁引流”，當(dāng)類器官擴(kuò)增到一定階段后，再降低 Wnt 信號(hào)強(qiáng)度，并加入地塞米松，以促進(jìn)肝細(xì)胞的代謝成熟，并增強(qiáng)了細(xì)胞間緊密連接的形成，還有助于形成微細(xì)的膽小管網(wǎng)絡(luò)，以期未來(lái)整合膽管類器官后轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝膽汁酸。

最終，在優(yōu)化的EM2培養(yǎng)基中，團(tuán)隊(duì)成功從28位年齡跨度為11至85歲的患者（包括5份凍存肝細(xì)胞樣本）中100%成功建立了h-HepOrgs。這些類器官表現(xiàn)出極強(qiáng)的擴(kuò)增能力，能夠以1:2的比例每周傳代，持續(xù)擴(kuò)增超過(guò)3個(gè)月（10代以上），且在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中始終保持穩(wěn)定的染色體數(shù)目。

h-HepOrgs可長(zhǎng)期擴(kuò)增

h-HepOrgs不僅在數(shù)量上實(shí)現(xiàn)了突破，在結(jié)構(gòu)和功能上也表現(xiàn)出對(duì)體內(nèi)肝組織的深度復(fù)刻。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，擴(kuò)增態(tài)的h-HepOrgs具有顯著的增殖特征，其基因表達(dá)譜與肝切除后的再生組織高度相似。當(dāng)類器官轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（DM）后，其增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)迅速下降，而功能性肝細(xì)胞標(biāo)志物顯著上調(diào)。

在微觀結(jié)構(gòu)上，h-HepOrgs能夠形成類似于體內(nèi)組織的細(xì)長(zhǎng)三維膽管結(jié)構(gòu)，這些膽小管表面表達(dá)CD13、ZO-1和radixin等極性標(biāo)志物。功能測(cè)試進(jìn)一步證實(shí)，分化后的h-HepOrgs在白蛋白分泌能力和細(xì)胞色素P450活性（如CYP2C9）方面，與體外培養(yǎng)7天的原代肝細(xì)胞相當(dāng)。值得注意的是，在維拉帕米代謝實(shí)驗(yàn)中，h-HepOrgs產(chǎn)生主要代謝產(chǎn)物去甲維拉帕米的能力甚至超過(guò)了培養(yǎng)1天的原代肝細(xì)胞，這反映了其內(nèi)部復(fù)雜的CYP酶系（如CYP2C8、CYP3A4/5）的高度協(xié)調(diào)性。

此外，該平臺(tái)還捕捉到了不同患者間的代謝差異，展示了其在個(gè)性化藥物代謝研究中的巨大潛力。

h-HepOrgs 保持體內(nèi)功能和患者特異性特征

為了評(píng)估這些體外擴(kuò)增細(xì)胞的生物學(xué)效能，研究團(tuán)隊(duì)將其移植到了I型酪氨酸血癥（Fah^-/-Rag2^-/-Il2rg^-/-）小鼠模型中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植后的h-HepOrgs細(xì)胞能夠成功植入小鼠肝實(shí)質(zhì)，并維持正常的肝細(xì)胞功能。

在關(guān)鍵的生存率測(cè)試中，注射了50萬(wàn)個(gè)h-HepOrgs細(xì)胞（無(wú)論是擴(kuò)增態(tài)還是分化態(tài)）或原代肝細(xì)胞的小鼠，在撤除NTBC藥物后，其生存曲線顯著優(yōu)于對(duì)照組。這些移植細(xì)胞成功挽救了小鼠的致命性表型，證明了通過(guò)該技術(shù)擴(kuò)增的肝細(xì)胞在組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域具有極高的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

由于膽管類器官的生長(zhǎng)極度依賴于 Wnt 和 Notch 信號(hào)通路的協(xié)同作用，研究團(tuán)隊(duì)還添加了R-spondin 1、FGF10、EGF、HGF、煙酰胺、TGF-β 抑制劑（A83-01）以及福司可林以誘導(dǎo)管腔擴(kuò)張，并增強(qiáng)膽管細(xì)胞的分泌功能。

此外，為了使組裝體盡可能接近體內(nèi)真實(shí)比例，團(tuán)隊(duì)通過(guò)量化發(fā)現(xiàn)肝組織中膽管細(xì)胞、門管區(qū)成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞的比例約為 15% : 8% : 77%。基于此，他們將1個(gè)肝細(xì)胞類器官與約100個(gè)膽管細(xì)胞和25個(gè)成纖維細(xì)胞混合。

在AggreWell平板中培養(yǎng)24小時(shí)后，三種細(xì)胞自發(fā)組裝成緊湊的復(fù)合結(jié)構(gòu)，并在培養(yǎng)6至16天后形成了穩(wěn)定的門管區(qū)樣排布：膽管細(xì)胞構(gòu)成的管腔處于中心或特定的功能單元內(nèi)，其基底側(cè)被門管區(qū)成纖維細(xì)胞（PFs）精密包裹，形成一層薄薄的間質(zhì)支撐層。最后，這一膽管-間質(zhì)復(fù)合體被厚實(shí)的人原代肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)所包圍。這種由內(nèi)向外的“膽管-間質(zhì)-肝實(shí)質(zhì)”層級(jí)結(jié)構(gòu)，完美復(fù)現(xiàn)了天然肝小葉門管區(qū)的典型解剖布局。

人類門周組裝體重現(xiàn)了體內(nèi)肝臟門周組織

在生理功能上，通過(guò)熒光示蹤證實(shí)肝細(xì)胞內(nèi)的微觀膽小管網(wǎng)絡(luò)已與膽管類器官的大型管腔成功“對(duì)接”，實(shí)現(xiàn)了從肝細(xì)胞到膽管的完整膽汁引流通路；

分子水平的單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)一步顯示，組裝體中的肝細(xì)胞特異性增強(qiáng)了如 CYP2F2 等門管周圍區(qū)標(biāo)志基因的表達(dá)，展現(xiàn)出明確的空間區(qū)室化特征；

同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)還驗(yàn)證了成纖維細(xì)胞與膽管細(xì)胞間通過(guò) Jagged1-Notch 等信號(hào)通路進(jìn)行的復(fù)雜細(xì)胞互作，這種對(duì)話維持了組織的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)；

最后，在代謝表現(xiàn)上，組裝體的尿素生成、糖異生和白蛋白分泌能力（均為門靜脈功能）顯著優(yōu)于單一類器官模型，并能高度仿真膽管擴(kuò)張等纖維化病理反饋，從而在解剖、分子、生理及病理四個(gè)層面完成了對(duì)門管區(qū)微環(huán)境的系統(tǒng)性還原。

這一高度仿生的組裝體平臺(tái)為研究復(fù)雜的肝臟疾病提供了理想工具。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將成纖維細(xì)胞的比例增加20倍（即1個(gè)肝細(xì)胞類器官對(duì)應(yīng)500個(gè)成纖維細(xì)胞），構(gòu)建了“纖維化樣”組裝體。在這種病理模型中，研究人員觀察到了典型的纖維化特征，包括TGFβ信號(hào)通路的顯著激活，這與原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）和原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）患者的轉(zhuǎn)錄組特征高度吻合。

形態(tài)學(xué)上，纖維化組裝體出現(xiàn)了明顯的囊性病變，類似于患者組織中的導(dǎo)管反應(yīng)。更深入的免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，在纖維化環(huán)境下，部分肝細(xì)胞（HNF4A⁺）開始表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志物KRT19，并形成了管腔結(jié)構(gòu)，這揭示了在過(guò)度間質(zhì)擠壓下肝細(xì)胞向?qū)Ч芗?xì)胞轉(zhuǎn)分化的潛在病理過(guò)程。此外，模型還成功模擬了纖維化過(guò)程中常見的TNF、IL-4和IL-6信號(hào)富集以及肝細(xì)胞凋亡增加等特征。

組裝體模擬人類膽道纖維化的某些方面

Meritxell Huch團(tuán)隊(duì)的這一研究成果標(biāo)志著肝臟體外建模從“單細(xì)胞類型類器官”邁向了“多細(xì)胞復(fù)雜組裝體”的新階段。通過(guò)建立包含28位捐贈(zèng)者的活體類器官庫(kù)，研究者可以更深入地探索個(gè)體差異對(duì)肝臟再生、代謝和疾病進(jìn)展的影響。

這種能夠精準(zhǔn)復(fù)刻人類門管區(qū)組織架構(gòu)的組裝體系統(tǒng)，不僅為解開膽管纖維化等慢性肝病的分子機(jī)制提供了新平臺(tái)，也為藥物篩選和毒性測(cè)試提供了比動(dòng)物模型更具人體相關(guān)性的選擇。隨著技術(shù)的不斷成熟，這一平臺(tái)有望在加速創(chuàng)新藥物研發(fā)、實(shí)現(xiàn)早期精準(zhǔn)診斷以及推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療領(lǐng)域發(fā)揮核心作用，為全球數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的慢性肝病患者帶來(lái)新的希望。