一個(gè)基因的表達(dá)受多種表達(dá)元件調(diào)控，有啟動(dòng)子，增強(qiáng)子/沉默子，5’UTR，3’UTR，轉(zhuǎn)錄因子，microRNA等，當(dāng)我們需要驗(yàn)證其具體功能，如啟動(dòng)子的活性，5’UTR和3’UTR是否影響基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子是激活還是抑制，microRNA在靶基因3UTR上的結(jié)合位點(diǎn)，一段特定序列是否有增強(qiáng)子/沉默子功能時(shí)，螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因就是很好的一個(gè)用來(lái)驗(yàn)證功能的工具。
今天就以pGL3 promoter和pGL3 Basic兩個(gè)載體來(lái)簡(jiǎn)單說(shuō)明如何驗(yàn)證這些表達(dá)元件的功能，這兩個(gè)載體都帶有螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因，區(qū)別是pGL3 promoter在螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因上游有SV40啟動(dòng)子，而pGL3 Basic則只有螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因。請(qǐng)大家一定要注意待研究元件相對(duì)于螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的位置，位置不同，功能不同。
1、 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性/轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證
啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性對(duì)于一個(gè)基因表達(dá)至關(guān)重要，通常做法是：預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列，默認(rèn)取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp作為可能的啟動(dòng)子，將預(yù)測(cè)得到的序列構(gòu)建到pGL3 Basic載體螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的上游，通過(guò)報(bào)告基因判斷啟動(dòng)子活性。與啟動(dòng)子形影不離的就是轉(zhuǎn)錄因子的，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于基因的表達(dá)也很關(guān)鍵。我們獲得啟動(dòng)子序列后，需要通過(guò)專(zhuān)門(mén)的軟件來(lái)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)子區(qū)上的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)consensus sequence序列進(jìn)行突變?cè)O(shè)計(jì)，然后通過(guò)于突變?nèi)笔ЫM對(duì)比，判斷轉(zhuǎn)錄因子的功能以及在啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)。
2、 microRNA結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證
對(duì)于編碼基因而言，通常認(rèn)為microRNA是通過(guò)結(jié)合到編碼基因的3‘UTR來(lái)發(fā)揮作用。具體做法是：使用專(zhuān)門(mén)的網(wǎng)站比如targetscan進(jìn)行編碼基因于3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，獲得可能的結(jié)合位點(diǎn)后，結(jié)合位點(diǎn)上下游延伸100bp左右的序列，將序列構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因下游。根據(jù)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因判斷microRNA是否對(duì)編碼基因有調(diào)控作用。一般做法：同時(shí)構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)相應(yīng)的突變型序列質(zhì)粒，野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒做對(duì)比。
3、 5’UTR和3’UTR功能驗(yàn)證
對(duì)于一個(gè)編碼基因，通常都會(huì)有5’UTR和3‘UTR，有些編碼基因他們的5’UTR和（或）3‘UTR可能會(huì)對(duì)基因的表達(dá)有影響。5’UTR具體做法是：將編碼基因的5’UTR構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的上游，SV40啟動(dòng)子下游，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)來(lái)判斷5UTR’對(duì)基因表達(dá)的影響。而對(duì)于3’UTR具體做法是：將編碼基因的3’UTR構(gòu)建到
或者3’UTR構(gòu)建到pGL3 promoter載體螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的下游，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)3’UTR的功能，這里的3’UTR通常都是全長(zhǎng)。提供一篇文獻(xiàn)Med Sci (Basel). 2017 Dec 22;6(1). pii: E2.The ODC 3'-Untranslated
Region and 5'-Untranslated Region Contain cis-Regulatory Elements: Implications
for Carcinogenesis參考。
4、 增強(qiáng)子/沉默子功能驗(yàn)證
增強(qiáng)子/沉默子功能驗(yàn)證的通常做法是：將增強(qiáng)子/沉默子構(gòu)建到pGL3 promoter載體SV40啟動(dòng)子的上游，如果確實(shí)有增強(qiáng)子或者沉默子功能，那就會(huì)影響SV40啟動(dòng)子的活性，通過(guò)這種結(jié)構(gòu)來(lái)驗(yàn)證功能。
5、 效應(yīng)元件(response element)功能驗(yàn)證
轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)元件的序列通常都是很短的一段堿基序列，比如p53效應(yīng)元件，NFkB效應(yīng)元件。通常做法是：構(gòu)建這段序列的多個(gè)重復(fù)，然后后面接一個(gè)miniCMV（minimal CMV (miniCMV) promoter is a
low expression synthetic promoter in mammalian cells），然后構(gòu)建到pGL3 Basic載體螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的上游進(jìn)行功能驗(yàn)證。
那螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因還有其他用法嗎？答案肯定是：當(dāng)然有??！這些我認(rèn)為是比較高大上一些，舉例：
1、 螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因做示蹤標(biāo)記干細(xì)胞，將目的基因與螢火蟲(chóng)熒光素酶基因融合融合表達(dá)，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)行干細(xì)胞移植。
2、 用螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因做活體成像來(lái)做藥效學(xué)評(píng)價(jià)，特別是在抗腫瘤新藥研究中應(yīng)用較多。
3、 類(lèi)似于熒光蛋白，將熒光素酶基因的C端和N端分別連在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上，若兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用，則用成像技術(shù)研究活體動(dòng)物體內(nèi)他們的相互作用。